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脂肪干细胞分离纯化方法的新研究成果 　　脂肪干细胞（ adipose-derived stem cells） 来源于脂肪组织，取材方便、对自体损伤较小，具有自我更新、多向分化能力、自体移植不发生排斥反应等特点，是组织工程中最有应用前景的种子细胞之一。量很低，占 3%左右，并且分离出来的细胞纯度不理想[1].因此如何获得足够量的、活性高的、高纯度的细胞极为重要。随着科研技术的不断发展，研究者提出了脂肪干细胞不同的分离纯化方法。本文就近年来脂肪干细胞分离纯化方法的新研究进展作一综述。 　　1 脂肪干细胞分离方法 　　1. 1 组织块贴壁法 　　组织块贴壁法即将脂肪组织剪成适宜大小的组织块，然后将组织块贴壁到培养瓶中进行培养[2].此法的核心是确保脂肪组织块贴壁，但在实际操作中很难保证每块组织块贴壁，尤其是在换液过程中，组织块很容易漂浮，导致脂肪组织的浪费。 　　Jing W 等人[3]采用组织块贴壁法分离培养 8周龄 BALB/c 小鼠脂肪干细胞时，在脂肪组织剪碎之前，先吸取脂肪组织表面附着的多余水分，将脂肪组织块接种到培养瓶后让组织块贴壁一段时间后再加入细胞培养液，这样的处理可以使脂肪组织块更加牢固地贴在培养瓶上。本实验室采用此法分离脂肪干细胞时将组织块接种到培养瓶后置于培养箱内培养 30 min 后再加入培养液，使得组织块贴壁更加牢固[4]. 　　1. 2 酶消化法 　　酶消化法为原代细胞培养常用的方法之一，原理是利用新鲜离体组织的细胞生物学特性未发生明显的变化，仍具有二倍体遗传特性，通过消化液去除细胞间质，使细胞能够更好地吸收外界营养和排出代谢产物，短时间内获得大量的活细胞。脂肪组织酶消化法即脂肪组织被剪成碎块置于酶中消化，再通过过滤、洗涤和离心等步骤去除漂浮在上层的脂肪细胞和油脂，从而得到脂肪干细胞。JiangA 等[5]通过酶消化法从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞，所培养的细胞贴壁生长、细胞形态为典型的长梭形成纤维样，表达脂肪干细胞特殊的表面标记物 CD29、CD44、CD105,阴性表达造血干细胞相关的表面标记物 CD34、CD45. 　　酶消化法实际上是一种费时、昂贵的方法，尤其是在需要分离大量脂肪组织的时候，其弊端显得更为突出； 在酶的种类、浓度、消化时间上存在很大差异，缺乏统一的标准，大多数研究者采用型胶原酶消化分离原代细胞[6],少数采用 型胶原酶[7]、IV 型胶原酶、VIII 型胶原酶[8]、胰酶[9]或者胶原酶联合应用胰酶[10]进行消化分离，酶的使用浓度从0. 05 ~ 2. 5 g/L 不等[11 -14],消化时间范围为0. 5~ 3 h[15 -17],从而使得分离出来细胞的活性、表型、潜能存在一定的差异； 另一方面，市场上的胶原酶和胰酶纯度不高，可能包含有色素、内毒素、异种抗原、异种蛋白酶体[18 -19]; 消化法获得的脂肪干细胞不纯； 人为操作过多，容易造成污染； 此外，需要的脂肪组织量较大，当脂肪组织量较少时，采用此法无法扩增出足够量的脂肪干细胞用于后续分析[20]. 　　Griesche N 等[21]在常规胶原酶消化法分离脂肪干细胞的基础上作了一些改进，在消化获得的细胞接种培养 60 min 后马上进行换液，与常规胶原酶消化法相比，此法可以明显减少 desmin、smA 和 six2的表达，提高干细胞标记物 nestin、oct-4 和 sall-1 的表达。Carvalho PP 等[22]使用临床级的无异源蛋白的释放酶消化人脂肪组织，消化获得的脂肪干细胞活性和功能与使用科研级的胶原酶、胶原酶 A、胶原酶 NB4 相比无明显区别，表明高度纯化的释放酶可替代科研级的胶原酶，减少酶中异源蛋白对脂肪干细胞的污染。Güven S 等[23]使用 sepax 装置自动分离脂肪干细胞，方法是将样品和胶原酶装入转移袋中，37孵育 1 h 后，转移袋与 CS-490. 1 试剂盒相接，在 sepax 装置中启动 CS-490. 1 试剂盒开始自动消化，收集消化所得细胞，此装置分离得到的脂肪干细胞比传统的手动消化法效率高、细胞产量高、人为干预少。胡金灵等[24]分离 SD 大鼠脂肪干细胞时采用 0. 25% 型胶原酶消化脂肪组织30 min,离心，将获得的细胞接种培养获得所需的细胞，此法提高了胶原酶浓度，缩短消化时间，可减少胶原酶对细胞活性的影响； 省略了传统胶原酶消化法中筛网过滤和红细胞裂解两个步骤，降低人为操作、试剂对脂肪干细胞的损伤。 　　1. 3 其他方法 　　近几年来，除了传统的脂肪干细胞分离方法，还有些寻求突破的新方法出现。 　　1. 3. 1 吸附柱法 　　Ito K 等[25]于 2010 年首次使用由非织造织物组成的装置从骨髓中成功分离出间充质干细胞，分离出来的细胞表达间充质干细胞