小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定.docVIP

实验：小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 1：《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。2、《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验方案: —离心、层析、比色、电泳。 熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。 4. 实验原理 匀浆原理： 分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。 盐析原理： 蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。 透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。 层析原理： 凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。 ） SDS图譜 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 【器材】 1、动物：成年小鼠 2、器材：手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，50mL量筒，100mL烧杯，50mL锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4℃冰箱，纱布，滤纸 3、试剂：0.05mol/L醋酸-乙醇（23.5％）缓冲液，pH4.0；氯仿 【】 1、 颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏； 2、 加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇，），用组织捣碎机匀浆-3min（三组合并。【留样】3、 缓慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min；匀浆液离心，4℃，00rpm，30min后，弃沉淀，收上清液。 、 取匀浆后上清液0uL，加入0 uL 4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS检测，-20℃冰箱保存。【留样】另取0 uL匀浆后上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 1、100mL，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管2、试剂：0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl