带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达_论文.docxVIP

带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达 【摘要】目的:构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的可调控腺病毒载体,并在SW620结肠癌细胞株中观察其调控表达.方法：将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子，以及RU486调控系统构建成单一的穿梭载体PDCRULUC，将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后，构建出可调控的重组腺病毒载体.扩增后用最终稀释法测定了其滴度，并在SW620细胞中检测了其基因调控效果.结果：成功地构建了携带有RU486调控系统的可调控腺病毒载体AdRULUC，病毒滴度达到×1013pfu/L.当给予诱导剂RU486后，腺病毒载体可以诱导表达荧光素酶，并在一定范围内两者呈正比，而没有RU486时，几乎没有报告基因的表达.结论:腺病毒AdRULUC能调控外源基因的表达，为基因调控研究和基因治疗提供了良好的工具. 【关键词】腺病毒载体基因调控末非司酮荧光素酶 0引言 利用腺病毒载体转移外源基因是基因治疗和基因功能研究中常用的方法.随着腺病毒载体系统研究的深入，尤其是空壳载体的成功应用，外源性基因表达的效率和时间有了明显的提高［1］.然而，基因的过度表达或不适当的表达不仅影响到对其功能的研究，而且在基因治疗中也可能会对机体产生致命的副作用，因此实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控是非常重要的，也是目前载体系统的难点之一.通过诱导调控系统来实现基因的精确表达是最常用的方法，在已构建成的多种诱导调控系统中，RU486诱导调控系统具有诸多优点，是目前功能相对完善的基因调控系统，其应用日益广泛［2］，为此，我们将RU486诱导调控系统与腺病毒载体相结合，成功构建了RU486诱导调控的腺病毒载体，并用荧光素酶报告基因，在体外验证了其对基因表达的调控作用，在国内少见类似报道. 1材料和方法 材料SW620结肠癌细胞株购自中科院上海细胞所；腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3cre和HEK293细胞株购自加拿大MicrobixBiosystems公司；pDC313穿梭载体；含有启动子和绝缘子的pBInshCMV质粒均为东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室保存；萤火虫荧光素酶质粒pGL3Basic购自Promega公司；含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子两个组件的质粒pRS由西班牙Navarra大学医学院钱程教授惠赠.各种限制性内切酶购自NewEnglandBiolab公司；诱导剂RU486购自SIGMA公司；DNA连接试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；新生小牛血清购自Gibco公司；LuciferaseReporterAssay购自Promega公司；真核细胞转染试剂lipofectamine2000购自Invetrogen公司；胎牛血清、小牛血清购于GibcoBRL公司，胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、病毒DNA提取试剂盒均购于QIAGEN公司.LB9506型Luminometer(Berthold公司)；PCR仪(德国BIOMETRA公司)；Napc05420二氧化碳孵箱(法国JOAVN公司)；6孔板(丹麦NUNC公司).PCR引物设计采用OLIGO分析软件在计算机上进行,正义引物和反义引物的5′端均设计有酶切位点,且其外侧设有保护性碱基.萤火虫荧光素酶（LUC）基因鉴定引物序列如下：正义引物5′CGCATGCCAGAGATCCTATTT3′，反义引物5′CGGGAGCCACCTGATAGC3′，引物由Invetrogen公司合成. 方法 穿梭质粒构建与鉴定利用分子生物学技术，将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子，以及RU486调控系统构建成单一的质粒载体PDC－RULUC，为减少两个转录单元之间的潜在干扰，加入了1600bp的绝缘子.载体构建流程如下：①pBInsluc用NheI和KpnI切下的Insluc片段,插入pRS17质粒的NheI和KpnI位点,重组质粒命名为pRSRULUC.②NotⅠ单酶切下pRSRULUC中的调控表达框和LUC基因表达框部分装入pDC312载体的NotⅠ位点中，构建成穿梭质粒pDCRULUC.通过PCR和限制性内切酶及测序，筛选阳性重组子. 重组腺病毒的制备与鉴定重组腺病毒载体AdRULUC的构建采用AdMax腺病毒载体包装系统.将穿梭质粒pDCRULUC与以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3cre，通过lipofectamine2000试剂共转染至293细胞，通过Cre/loxP重组酶介导下的位点特异性重组，使共转染到293细胞中的穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒.