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增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法研究 　　黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD），属黄素蛋白酶类，可将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，继续氧化黄嘌呤为尿酸，并产生过氧化氢及超氧化物，是嘌呤代谢的关建酶。 可用于检测血清无机磷、血清超氧化物岐化酶活力及胞外黄嘌呤、次黄嘌呤水平。 　　在核苷类药物的合成中起到促进转化的作用，可用于提高 5-甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷的合成产量。不同生物来源的黄嘌呤氧化酶酶学性质具有差异性。 来源于细菌的黄嘌呤氧化酶国内外研究较少，已报道黄嘌呤氧化酶的相对分子质量及亚基组成差异较大，蛋白结构组成的差异将导致酶催化性能及稳定性的不同。 　　黄嘌呤氧化酶作为一种重要的氧化酶，其在医学诊断及工业催化中有应用前景，酶较差的稳定性影响其直接应用。 已报道的提高酶稳定性的方法主要有添加保护剂、蛋白质工程、固定化方法等。 其中，固定化方法因具有可连续反应性、可重复利用性等优点，备受关注。 可使用的固定化载体主要有聚丙烯酰胺、壳聚糖、醋酸纤维素薄膜、树脂等。国内外关于黄嘌呤氧化酶稳定性研究，主要集中于改进溶液环境提高酶热稳定性，对其固定化研究相对较少。 　　前 期 经 SDS 电 泳 分 析 知 ， 节 杆 菌Arthrobacter M3 黄嘌呤氧化酶含两个亚基， 相对分子质量约为 100 000 及 35 000，与 已 报道的 黄嘌呤氧化酶均不相同。 在此基础上，作者对此黄嘌呤氧化酶的酶学性质进一步分析，并利用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶。 提供有效增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法，也为其它酶类的稳定性研究提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌种来源 　　Arthrobacter M3：作者所在实验室保藏菌种。 　　1.2 主要材料 　　黄嘌呤氧化酶标准品（相对分子质量 160 000）：近岸蛋白质科技有限公司提供；大孔阴离子交换树脂 （D201、201×4）， 浙江争光实业股份有限公司提供；Sepharose 4B： 通用电气医疗中国有限公司提供；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司提供。 　　1.3 主要仪器 　　V1100D 可见分光光度计： 美谱达仪器有限公司产品；电热恒温水浴锅：科辉仪器厂产品；蛋白电泳仪：美国 BIO-RAD 公司产品；pH 计（PB-10 型）：德国赛多利斯股份有限公司产品。 　　1.4 培养及纯化方法 　　从固体平板挑取单菌落，接入种子培养液，30 恒温振荡培养 12 h。 后将种子培养液按体积分数3%接种量接入 60 mL （500 mL 锥形瓶） 发酵培养基，30 、220 r/min 培养 20 h。 菌液破壁离心后，取上清酶液进行纯化，参考文献[17]。 纯化后酶液经0.22 μm 滤膜过滤，置于 4 保存备用。 　　1.5 XOD 酶活测定方法 　　黄嘌呤氧化酶酶活测定方法详见参考文献。酶活力单位定义：在 37 下，每分钟形成 1 μmol 过氧化氢所需的酶量定义为 1 个酶活单位（U）。 　　1.6 XOD 酶学性质分析 　　1.6.1 凝胶过滤确定 XOD 相对分子质量 以商业化的黄嘌呤氧化酶（相对分子质量 160 000）标准品为对照，利用安捷伦 SEC-5（7.5 mm×300 mm，5 μm）凝胶过滤柱测定 XOD 相对分子质量。 测定条件：流动相 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0），流量 0.5mL/min，进样量 40 μL，检测波长 280 nm。 　　1.6.2 酶的最适反应温度及最适反应 pH 取一定浓度的稀释酶液，于 25~52 水浴条件下进行酶活力测定，以活力最高者为 100%，计算不同温度下相对酶活。 另取一定浓度的稀释酶液，于 37 、不同pH 条 件下 （5.5~9.0）进 行 酶 活 力测定 ，以 活力 最 高者为 100%，计算不同 pH 条件下相对酶活。 　　1.6.3 金属离子对酶活的影响 在 pH 7.5 酶液中加入不同金属离子 （Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ag+、Hg2+），至终浓度为 2 mmol/L，混匀，测定各组酶活，以未加金属离子的酶液酶活为 100%，计算各组相对酶活。 　　1.7 XOD 固定化方法比较 　　1.7.1 大孔阴离子交换树脂固定化 分 别称取 已预处理的 201×4 阴离子交换树脂及 D201 大孔阴离子交换树脂各 1.0 g 于 10 mL 离心管中， 加入 pH7.5 的酶液 6 mL，4 、100 r/min 下振荡固定化 2 h。 　　混合物 8 000 g 离心 5 min，测定上清酶活。后用 20mmol/L 磷酸盐缓冲液洗涤至无酶析出，测定洗