植物组织培养技术课件：第八章 原生质体培养和细胞融合02.pptVIP

第二节 体细胞杂交;一、原生质体融合;1、物理方法 利用离心、振动、电刺激等物理方法促使原生质体融合。 电融合： 1）微电极控制仪：两个微电极尖端，同时与两个靠近的原生质体表面接触，用5～12μA电波1～5ms（毫秒）。原生质体发生暂时收缩，引起了原生质膜状态暂时变化，从点连到面再到形成球形融合体约需要20～30min。 2）平行电极： 融合槽的两极通过交流电场产生电泳效应，电场产生的力作用于原生质体，使之偶极化，原生质体相互接触形成珍珠串。加适当强度的直流电脉冲，高强度的只需几个微秒就细胞膜发生可逆穿击而形成融合体。 ;细胞融合仪 ; 神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命 。;2、化学方法： 以不同的试剂为诱导剂，如各种盐类，多聚化合物，生物胶及其降解物等，促进原生质体融合。目前应用广泛的是Kao（1977）聚乙二醇（PEG）和高Ca2+法。 原理：PEG和原生质体表面负电荷通过Ca连接下形成静电键，促进原生质体间黏着和结合；在高Ca和高pH溶液处理下，Ca和PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调而重新分配，使原生质体某些阳电荷和另一些原生质体阴电荷连接、吸附、聚合，最后融合在一起。 PEG+高Ca2+-pH法： 将分离好的不同原生质体悬浮液作为供试材料。 配置适宜浓度的聚乙二醇（PEG）溶液与稀释清洗液。 ;原生质体的融合： 混合等体积的两种原生质体悬浮液，加入PEG溶液并诱导两者接触、融合；用稀释清洗液冲洗（高Ca2+-pH法）。 培养： ;二、融合过程 膜融合：生物膜融合是重要生物学现象，常态膜融合，内胞饮、外胞饮；非常态，如受化学的、物理的、生物的（噬菌体、病毒）等因素的刺激引起细胞病理状态的反应。 从膜融合的过程来看，可以把膜融合的反应分成接触，诱导，融合，和稳定四个时期。而Ca2+、ATP、及ATP酶可调节膜融合的变化；质膜上磷脂状态的改变可以影响质膜构型和流动性的报道。 核融合： 有丝分裂核的融合，融合处理后形成了多核细胞，由于DNA合成不同步，不协调发生核分裂紊乱，形成多中心，核分裂而细胞质不分裂，核合并成块等异常现象，因此多核细胞难以成活。 双亲进行同步分裂，形成共同纺锤体，染色体排列在分裂中期的赤道板上，再继续进行到分裂后期，这样所形成的融合核可继续分裂。 ;三、融合细胞的筛选 ;2、机械筛选： 荧光染料标记：单标记、双标记;四、杂种植株的鉴定;3 同工酶谱分析;;;Southern杂交的鉴定;;The prospects of success with the genetic manipulation of plants has created considerable public interest. Melchers and his co-workers (1978) produced a hybrid plant from the fusion of potato and tomato protoplasts, allowing the transfer of genetic information from two different organisms. The method provides the opportunity of producing hybrids between related but sexually incompatible species. ;;五、外源DNA的摄入 1、以质粒或病毒为载体与DNA片段重组，然后导入细胞内。 2、以含有目的基因的(Ti质里粒cDNA)农杆菌为媒介，以原生质体为受体，采用共培养方法。 3、直接导入DNA的法： PEG为中介的基因转移法、电穿孔法、显微注射法、强压轰击法以及超声波法等。