微图案化表面的制备以及细胞间接触影响干细胞分化的研讨.pdf

摘要 调控细胞行为、尤其细胞黏附和干细胞分化是再生医学领域的一个研究重 点，涉及到细胞生物学、医学、材料学等学科知识。迄今已有许多研究考察了生 物材料模拟细胞外基质的物理、化学等特性去控制细胞的黏附，进而调控细胞的 生命活动。但对细胞与细胞之间接触如何影响干细胞分化的研究则相对很少，已 有研究的结论也有待确证，且不能定量给出接触程度与分化程度之间的关系。这 并非因为细胞间接触对细胞生命活动不重要，在很大程度上是由于缺乏必要的研 究技术手段，很难排除细胞密度变化导致的细胞自身分泌的因子浓度变化等因素 的干扰。 传统的细胞研究方式，比如在培养板上研究细胞，难以克服细胞迁移等问题， 新发展起来的微图案技术则可以实现细胞定位，有助于研究细胞间接触等影响细 胞生命活动的相关问题。本论文尝试了多种微图案制备方法，最终从中寻找到了 一种能长时间阻止细胞迁移的微图案。我们以此首次定量考察了细胞接触程度对 于干细胞定向分化的影响。我们的这些实验技术和方法，以及细胞研究结论不仅 丰富了细胞学知识，也为细胞学研究提供了新的手段和途径；对再生医学领域里 面诸如组织修复材料的设计、干细胞调控等提供了一些基本的实验和理论知识。 本论文的主要创新性研究包括以下几方面： 1．尝试了多种微图案制备方法，包括在PLGA膜上制备微拓扑形貌、PEG接枝 表面制备有细胞黏附反差的化学微图案、PEG水凝胶形成的微凹坑图案、PEG 水凝胶表面的化学微图案等。每种方法都反复摸索了详细的制备条件，根据 细胞定位实验，从中确定了PEG水凝胶表面的化学微图案能够长时间控制细 胞黏附位置，特别是阻止了细胞的迁移等运动，为后续的干细胞研究奠定了 基础。其它几种方法制备的微图案，尽管不能长时间限制细胞的黏附位置， 但也有各自的特点，适合于相应的细胞研究，例如微拓扑形貌可以调节细胞 铺展；PEG接枝的表面可以考察短时间内的细胞形态、黏附、迁移等问题。 2．建立了利用光学显微镜照片分析细胞内碱性磷酸酶活性的半定量分析方法。 骨髓基质干细胞被定位在微图案上后成骨分化，但在同一微图案上面存在不 同的细胞接触状况，比如有的细胞处于孤立状态；有的接触了一个细胞；有 的接触了两个，乃至多个不等的细胞，它们的成骨分化程度存在差异，却又 难以用直接测吸光度的方法来判别。比照分光光度法，我们通过染色、拍照， 测量细胞灰度值，并根据吸光值计算公式，定量分析了不同细胞接触情况下 的干细胞成骨分化水平。虽然我们是针对骨髓基质干细胞的成骨分化所建立 的分析方法，但这个方法同样适用于其它的，能够通过染色来定性、定量分 析的研究中。 3．利用之前确定的微图案制备技术以及建立的半定量分析方法，我们考察了细 胞接触对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化和成脂分化的影响。我们在同一基底 材料表面利用不同黏附圆岛导致不同细胞接触程度的技术排除了细胞密度变 化导致因子浓度不同等因素的干扰。我们的结论确证了细胞接触能够促进干 细胞定向分化，并首次发现这种促进作用与细胞接触程度成正比。我们还发 现缝隙连接是相关细胞接触的重要因素，但并非唯一因素。 关键词：再生医学、干细胞分化、细胞黏附、细胞定位、细胞接触、表面微图案 化、PEG水凝胶、骨髓基质干细胞、成骨分化、成脂分化、灰度值、半定量分 析 ABSTRACT The betweencellcommunicationanddifferentiationisafundamental relationship ofCell is relatedtoBiomaterialsand problem Biology，whichclosely Regenerative Medicine．Aseell studiesare differentiationofstemcellshasbeen concemed，while muchattentionto thelatest littleisfocusedthe paid duri