新型传感界面构建及其在农药分子检测和生物活性研讨中的应用.pdf

摘要 农药在为农业生产提供保障的同时其残留物也对环境和人类健康造成危害，这就对当前农 药研究提出了两方面的研究课题：一方面，发展快速、可靠的农药分析检测方法保障食品安全 和品质；另一方面，开发高效、低毒、低残留的农药新品种，从源头上降低农药残留带来的副 作用。将靶标蛋白与底物结合的高选择性和分子识别能力与电化学检测的灵敏、快速等特点结 合，成为研究高效、便捷的农药分析检测新方法的发展趋势。利用靶标蛋白与底物的分子识别 能力建立抑制剂离体生物活性分析方法，同样对实现新型农药候选化合物的初期筛选和先导结 构化合物验证具有重要意义。无论是农残检测还是药物筛选，界面构建和生物大分子的固定是 影响传感分析信号灵敏度和稳定性的关键因素。本文利用电化学和表面等离子体共振技术，以 于靶标蛋白分子识别的农药分子检测和生物活性研究新方法这一中心，开展了以下几个方面的 工作： 1．多壁碳纳米管．壳聚糖．乙酰胆碱酯酶复合界面的构建及其与底物的分子识别 利用戊二醛作为交联剂将AChE固定在壳聚糖与多壁碳纳米管组成的复合界面上。壳聚糖 作为载体固定酶，为AChE提供一个理想的微观环境以保持酶的活性，碳纳米管的引入能有效 降低酶催化产物硫代胆碱在电极上的氧化电位。固载的AChE能快速灵敏的催化溶液中的底物 氯化乙酰硫代胆碱(ATCI)，定量检测ATCI在2．0．20．0 IIM和20．0-400．0州两个浓度区间内 与电流响应有良好线性关系，AChE的表观米氏常数为1321．tM。该方法重现性好、灵敏度高、 响应迅速、稳定可靠，有望为酶抑制剂的检测提供一个经济、便利的检测方法。 2．构建多壁碳纳米管．交联壳聚糖．乙酰_l|1日碱酯酶复合界面用于杀虫剂检测及生物活性分析 以多壁碳纳米管交联壳聚糖复合膜固定AChE，采用竞争结合方法，分析溶液中的杀虫剂 与ATCI竞争结合表面固定的酶。电化学信号的降低与杀虫剂三唑磷的浓度在0．03．7．8pM和 7．8．32．0 gM浓度范围内呈现良好线性，并定性分析比较了西维因、马拉硫磷、乐果对AChE的 抑制效果，建立了基于AChE抑制的农药药效快速分析电化学方法。改变表面|司载的靶标酶蛋 白，可用于其它酶底物或模拟底物水解产物具有电化学活性的酶抑制剂的活性比较。 3．银纳米粒子．生物素复合界面固定乙酰胆碱酯酶检测有机磷农药 检测剑乐果在0．05．10．0州浓度范围内与酶抑制率呈线性关系，线性拟合的相关系数分别 0．9983，检测限为0．01p．M。 博士学位论支 ⑧DoCTORAI。DISSE影脒rlON 4．金纳米粒子标记的氨基甲酸酯与乙酰胆碱酯酶相互作用的表面等离子体共振研究 AChE通过共价键固定在11．巯基．1．十一酸的自组装膜上，将本课题组设计合成的两种抑 MI。 此体系结合竞争模式可以实现其它小分子农药类似物的免标记活性比较分析。 5．芯片表面原位形成金纳米粒子放大表面等离子体共振信号检测酶抑制剂 固定反应时间，SPR信号与AChE的活性有对应关系，根据酶活性的抑制程度建立了有机 磷农药三唑磷的高灵敏检测方法，在0．5—14．0“M浓度范围内，三唑磷浓度与SPR信号呈线性 关系，检测限为0．05肛M。在这个体系中，无论是酶、底物还是分析物都无需标记和固定，反 应在溶液中进行，为农药检测提供了一种简单、无标记、实时、灵敏的检测方法。 6．D1蛋白酶与二茂铁标记24肽相互作用的电化学检测及抑制剂活性分析 利用一步沉积法将氯金酸还原成金纳米原位沉积于电极表面构成金纳米．壳聚糖的复合界 表面。结果表明，溶液中的Fc．24P在2．0-65．0州的浓度范围内与电流响应呈现良好线性，通过 和NAl进行了生物活性分析。 7．D1蛋白酶与金纳米粒子标记24肽相互作用动力学的表面等离子体共振研究及其应用 金片表面修饰生成羧基化葡聚糖界面后将羧基活化，利用酰胺键将CtpA固定在芯片上。利 (Ms)-1，Kd=6．24x10-3s-1。当溶液中有酶的抑制剂存在时，抑制剂与底物竞争性结合界面固定的 CtpA。选取竞争性拟合模型拟合了抑制剂存在条件下的SPR数据，获得了抑制剂与酶的结合速 率常数、解离速率常数及亲合常数等动力学数据，为