多基因共表达载体的构建策略PPT.pptVIP

多基因共表达载体的构建策略 曹慧青，丁金凤 国外医学（分子生物学分册） 2002 Vol.24 No.1  多基因共表达载体的应用 表达异源多聚体蛋白的亚单位，如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素、转录因子等 同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自杀基因等。 策略一：多启动子表达载体 原理：带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个载体上，转录出多种不同的mRNA，并翻译出不同的蛋白。 优点：简便 缺点：①内部启动子占据载体上有限的克隆空间 ②启动子间相互干扰，造成不同基因的表达水平 不一致 策略二：剪切载体 原理：利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供体/受体位点，通过剪切初始转录本，形成不同的mRNA，分别表达两个基因 缺点：可变剪切机制未明，双基因表达效率很不稳定 策略三：表达融合基因 原理：两基因用linker（多选择中性疏水氨基酸）或直接相连，使用同一开放阅读框，翻译产生嵌合的一个双功能融合蛋白分子 优点：翻译水平等量表达，常用于阳性/阴性双选择标记载体、筛 选标记/报告基因载体的构建 缺点： ①可能由于构像的改变使其中一个或两个基因的功能受到 影响 ②若两基因产物有不同的细胞定位，也会影响基因的正常 功能。也就是说表达平衡，而功能并不平衡 不同来源的IRES序列组成不同，长度各异，在不同细胞类型中的作用也各异 来源于闹心肌炎病毒EMCV的该序列又称为不依赖帽的翻译增强子，在大部分细胞中可直接招募核糖体起始其下游顺反子的翻译。但对其实密码的位置要求严格，只有该序列中的第11个可作为起始密码。 来源于脊髓灰质炎或口蹄疫病毒的IRES序列对其后的任一个符合KOZAK序列的AUG均可有效的起始翻译，因而得到更为广泛的应用。 IRES序列置于两个顺反子之间时，它与第一个顺反子的终止密码的最佳距离为80bp。少于40或多于300-400bp会大大的降低IRES序列的翻译效率。