PCR扩增实验课件.pptVIP

聚合酶链式反应（PCR）（以酵母菌 16SrRNA 序列扩增为例） 食品微生物实验 实验目的 了解PCR反应原理 熟悉PCR反应流程 掌握PCR基本实验操作及步骤 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法 实验原理 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。以双链DNA为模板，由引物介导，在DNA聚合酶作用下，扩增目标基因片段。 PCR原理 DNA的半保留复制进行复制。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外扩增。 DNA体内外扩增条件对比 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 琼脂糖凝胶电泳 PCR反应后，需要对反应产物进行鉴定； 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法； “分子筛”和“电泳” 双重作用； 琼脂糖凝胶网使分子通过时会受阻，大分子在涌动受阻力大；因此在电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小； 核酸分子带负电，电泳时从负极向正极涌动。分子量较大的核酸涌动较慢，反之较快； DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小 试剂：2×Taq PCR MasterMix（包含dNTP 、Mg2+、Taq聚合酶、缓冲液等）、酵母菌 16SrRNA 上下游引物（up\down primer）、ddH2O、 酵母菌DNA模板、琼脂糖、GlodenView ； 缓冲液：50×TAE缓冲液； 仪器：PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统； 材料：EP管、枪头、微量移液枪、制胶板、梳齿。 1、在EP管中，按下述体系依次加入PCR试剂及模板： 2×Taq PCR MasterMix 10 ul ddH2O 8 ul DNA template 1 ul 16SrRNA up\down primer 各0.5 ul 2、将加好样的EP管放入PCR仪器，按下述程序进行反应： 94℃ 5min； 94℃ 15s ，56℃ 20s，72℃ 30s，30 cycle； 72℃ 8 min； 25℃ ∞ 3、将 50×TAE 缓冲液稀释到 1×TAE，备用； 例如：配置 500ml 1×TAE，需要50×TAE 10ml，加蒸馏水490ml； 4、用 1×TAE 配置浓度为 0.8%~1% 琼脂糖凝胶 例如：配置 100ml 琼脂糖凝胶即加入 100ml 1×TAE , 0.8g 琼脂糖； 5、在琼脂糖凝胶中加入glodenview（5ul / 100ml）； 6、将适量琼脂糖凝胶注入制胶槽，插入梳齿，冷却凝固； 7、待PCR反应完成后，在电泳槽中加入适量 1×TAE ，以放入琼脂糖凝胶后，刚好没过胶孔为宜； 8、将扩增产物加入胶槽，同时加入Marker； 9、将琼脂糖凝胶放入电泳槽，在90V电压下电泳30~60min； 10、电泳完成后，用凝胶成像系统观察记录结果。 THE END /v_show/id_XMjMxNzk5Njg0.html /programs/view/61aiWRmtkMk * * * * * * * * PCR概述 PCR原理 PCR的特点 PCR反应过程 琼脂糖凝胶电泳 上下游引物（单链DNA） 热能 Taq酶（耐热DNA聚合酶） 4种dNTP 目的基因或DNA片段 DNA的PCR扩增 提供3`端羟基的RNA片段 ATP 解旋酶 DNA/RNA聚合酶 连接酶 4种dNTP 基因组 DNA体内扩增 引物 能量 酶 原料 模板 缓冲