实验免疫学技术PPT.ppt

应用于免疫学的分子生物学技术;应用于免疫学的其他分子生物学技术;第一节 核酸分子杂交的探针标记;第一节 核酸分子杂交的探针标记;3. 探针： cDNA探针 基因组探针 寡核苷酸探针 RNA探针;3. 探针： cDNA探针 基因组探针 寡核苷酸探针 人工合成 根据氨基酸序列推导出核酸序列 RNA探针;3. 探针： RNA探针： 将目的基因克隆到Sp6或T7启动子下游的MCS中，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游消化重组质粒，使之线性化，加入Sp6或T7 RNA聚合酶、NTP和[α-32P]-UTP，即可以目的基因的DNA为模板合成高放射性的RNA探针。;4. 标记物的选择： 放射性核素标记物： 32P、3H、35S等 非放射性核素标记物： 半抗原：生物素、地高辛等 配体：生物素是亲和素的配体，故还可用生物素-亲和素反应进行杂交信号的检测 荧光素：FITC、罗丹明等，可以通过紫外线激发出荧光而被检测 化学发光探针：一些标记物可与某些物质反应发生化学发光现象。通过化学发光可以像放射性核素一样直接使X-线胶片上的乳胶颗粒感光。 ;4. 标记方法的选择： 体内标记法 体外标记法 不需要活体生物或细胞培养系统 标记前的分离和纯化方便，可以用时再标记，减少放射性核素污染 体外标记一般比体内标记的比放射活性高很多 ;DNA探针的酶促标记法 缺口平移法 随机引物法 PCR法 末端标记法;非放射性核素探针的Southern印迹杂交 地高辛标记检测试剂盒，此体系是将具有类固醇半抗原性质的地高辛配基标记的dUTP用随机引物法掺入到探针DNA链上，然后与靶DNA上的同源序列进行杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，在底物硝基蓝四氮唑（NBT)和BCIP存在下，进行酶联免疫显色反应，从而到达检测目的。;基因芯片实验程序;基因芯片实验程序;Gene chips的应用;免疫学其他实验技术;第二节 聚合酶链反应;定量PCR 半定量PCR 实时PCR,又称荧光定量PCR 常规PCR基础上运用荧光能量传递技术，加入荧光标记探针，借助荧光信号来检测PCR产物。提高了灵敏度，还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，根据CT值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。; ;PCR的应用举例 质粒???定 基因亚克隆 ;Fragments digested by EcpRI and Not I pGEX-CT703 PCR product;免疫聚合酶链反应，immuno-PCR，IM-PCR 将抗原、抗体反应与PCR结合构成的一种新技术，其原理和过程基本类似ELISA，不同的是PCR放大系统取代了酶标记的催化放大反应。 需要一个中间的连接分子将抗原、抗体复合物与一指示分子DNA连接起来，再通过PCR扩增指示分子，根据PCR产物的量间接的检测抗原的量。;IM-PCR的几种反应方式： 固相支持物?抗原吸附?特异性抗体?生物素化抗抗体?亲合素?生物素化DNA ?PCR 固相支持物?抗原吸附?特异性抗体?SPA生物素蛋白?亲合素?生物素化DNA ?PCR 固相支持物?包被单克隆抗体?抗原?多克隆抗体?生物素化抗抗体?亲合素?生物素化DNA ?PCR;实验举例IM-PCR检测NPY 实验材料： 亲合素，生物素化dUTP，生物素化羊抗兔IgG，NPY标准品，NPY单克隆抗体、NPY多克隆抗体、腺病毒六邻体基因引物，3型腺病毒 实验方法：;IM-PCR指示分子DNA的制备：;双抗体夹心IM-PCR：;IM-PCR的应用和发展 IM-PCR目前尚处于研究阶段，尚未有一个十分成熟和忙一的方法,配套试剂尚缺乏,所以应用得尚不多。 适用于检测一些含量特别少的抗原分子； ;免疫学其他实验技术;第三节 流式细胞术;流式细胞仪的特点： 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞;工作原理： 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM,又名FACS）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量; 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包饶着样品高度流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 ;第三节 流式细胞术;流式免疫荧光技术的应用： 测量细胞大小、内部颗粒的性状 检测细