2011生化与分子生物学实用技术课幻灯.ppt

分子生物学实验技术总体设计;时间：周三 地点：309室 实验：上午 1.PCR产物纯化回收（分组操作） 2.酶切（分组操作） 3.电泳 4.切胶回收 下午 1.连接 2.转化（分组操作）;时间：周四 地点：309室 实验：下午：质粒提取（分组操作） 酶切电泳（略） ;主要知识点：基因重组的概念及过程；用于重组DNA技术的理想载体应该具备的特点；获得目的基因的途径；真核表达体系的优点；常用真核细胞转染方法的种类；RT-PCR的基本实验步骤（包括PCR）；限制性内切酶的特点;重组DNA技术  Recombinant DNA Technology; 重组DNA技术相关概念 ;目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;重组; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;载 体;载体的特点;载体种类 ;质粒 (plasmid);;;;目的基因的获取;mRNA ; 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction  以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3 ′末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。这一过程成为PCR。; 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶（Taq 酶） dNTPs Mg2+ ;PCR的基本反应步骤 1.变性：将反应系统加热至95℃ ，使模板DNA 完全变性成为单链； 2.退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板 DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升至72℃ ，DNA聚合酶以dNTPs 为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。; PCR的基本反应步骤;5?;Cycle 3;重组DNA技术的基本过程及技术路线; mRNA 提取; 凝胶中回收PCR产物; 质粒的提取;以构建pBSK-Akt1-WT重组体为例 ;引物a(划线部分为HindⅢ酶切位点)： 5′-GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT-3′ 引物b(划线部分为BamHI 酶切位点)： 5′-ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG-3′;PCR产物末端限制酶切位点的切断情况;10×PCR反应缓??液 5.0 ?l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 ?l Ex Taq DNA聚合酶(5U/?l ) 0.25 ?l 引物 a (10pmol/?l ) 2.0 ?l 引物 b (10pmol/?l ) 2.0 ?l pCIS2-Akt1 5ng 加水至 50 ?l ; 电泳检测 PCR结果; PCR产物的回收和鉴定 ;; 电泳检测回收的PCR产物;二、PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切;2、限制酶操作时应注意的原则：;PCR产物(或pBluescript II/SK) 12μl 10×Y+/Tanqo（with BSA） 2μl HindⅢ(10U/ ?l ) 1.5μl BamHI (10U/?l ) 1.5μl 补水至 20μl ;三、PCR产物与载体的连接 ;四、重组体导入受体细胞 ;在重组DNA技