细胞超微标技术PPT.pptVIP

细胞超微标记示踪技术;前言;IF: 12.186 (2011);Chithrani et al. Nano Lett. 2006;Chithrani et al. Nano Lett. 2006;ZnO NPs附着于胶质细胞表面引起质膜表面囊泡结构的产生;TiO2 P25导致星形胶质细胞膜表面囊泡的聚集;6 h exposure;第一节 超微标记示踪技术的分类和评价;第一节 超微标记示踪技术的分类和评价;二、特异性标示技术 （一）弥散性标记物 1. 放射自显影术 2. 酶标记抗体或特异性复合物 3. 可溶性（非标记）酶和抗酶复合物（PAP） 4. 生物素和卵白素（Biotin-avidin）复合标记 （二）颗粒性标记物 1. 铁蛋白标记复合物；2. 各种微球体标记物 3. 生物大分子标记物，如α-2巨球蛋白；4. 金标记复合物 作为一项理想的技术方法，应具有多功能、多用途，既能用于透射电镜，也能用于扫描电镜和X线衍射分析。金标记技术能满足这些要求，是很有价值的标记示踪技术。;磁性－荧光多功能复合微球制备原理图 ;第二节 铁蛋白标记技术;亲和细胞化学技术和糖基化铁蛋白技术的应用。 亲和细胞化学技术的基本原理是将铁蛋白与生物素交联，利用生物素对卵白蛋白的高亲和力、以生物素－卵白蛋白－配体（或抗体）为桥，将铁蛋白标记在细胞的特定结构或物质上，以观察细胞超微结构及化学性质。 使用生物素－卵白蛋白标记技术的优点是方法灵敏，非特异性低，亲和力极强，可以进行双重或多重标记，简单方便，可以仅制备保存一种标记卵白素或标记生物素，而进行多种反应，以显示多种特定的物质结构。;第三节 金微粒（胶体金）标记技术;二、胶体金的特性、稳定性基标记原理 胶体金的特性主要取决于金微粒的直径、吸收光谱及其稳定性。 金微粒的大小可以用透射电镜直接测定。国际上通用的标示方法如WGA-Au5。 胶体金是一种疏水胶体，由吸附的周围离子云维持胶体的稳定性。胶体金的稳定性取决于胶体粒子的大小，颗粒越小越稳定，越不容易受电解质的干扰而凝聚。;目前已有三种稳定金属胶体溶液防止凝聚的方法。 （1）胶体颗粒表面吸附表面活性物质（如肥皂）以增加表面电荷密度及潜能。 （2） 吸附亲水大分子以降低粒子间的吸引力。 （3）吸附高分子多聚体以增加胶??溶液的立体稳定性。 此外，多糖和其他多聚物也能提高其立体稳定性。;典型样品的透射电子显微镜图 (a) Fe3O4; (b) 氨基化Fe3O4; (c) 胶体金; (d) Fe3O4/Au (15-20 nm);直径16~20 nm的胶体金的制备： 用干净非金属药勺和容器称氯金酸50 mg，溶于500 ml三蒸水中，制成0.01%的氯金酸液，煮沸，快速加入1%枸掾酸钠12.5 ml，边加边搅拌边加热，至5 min左右溶液由黄、蓝，变成深红色。冷却后用碳酸钾溶液调pH。 注意： 玻璃器皿应非常洁净，实际加入的次序要正确， 应用高纯度的去离子水。 注意颜色的变化: 电镜下金微粒应为圆球形或椭圆形的电子致密颗粒，不得有微粒的聚集凝结，而应完全呈现单个分散状态。可在无菌或特殊处理情况下保存数月。;四、金标记物的制备;五、胶体金标记物的应用和研究;（三） 透射电镜中的应用 在透射电镜下，以将特异性金标记法用于研究病毒、细菌、细胞、骨髓细胞、肝细胞神经组织等，显示细胞表面物质或细胞内部的物质结构。 常用的金微粒是Au5和Au20。 金标记可分为直接法和间接法。 直接标记法是用金标记物直接标记细胞结构。一般说来，标记在细胞表面的金微粒数量，随着金微粒的直径的增大而减小。 间接标记的反应程序是标本先用第一抗体血清处理后，再用金标蛋白A或金标第二抗血清处理。用间接法标记的B淋巴细胞较直接法标记的要强，非特异性要低。这可能是间接法可以提供更多的空间结合点之故。;（四） 超薄切片的金标记法;切片先用外源凝集素处理，然后与金标记多糖或糖蛋白孵育，显示外源凝集素－多糖或糖蛋白的标记定位。该法较直接法反应强，非特异性吸附少，但较麻烦，每次要制备所用的金标溶液。 金－蛋白A法。该法根据蛋白A能特异结合到各种IgG的FC段，制备了一种金-蛋白A标记液，使用各种不同的IgG抗血清，可显示各种相应的细胞抗原。需选择合适的抗血清滴度或用金标记免疫球蛋白替代金标蛋白A。 根据抗原抗体双价结合原理，可用金标记的抗原检测特异抗体。用微过量的2价抗体与组织细胞反应，使该2价抗体仅有一个抗原结合部分与组织抗原结合，剩余的抗原结合部分将与加入的金标抗原结合，显示某种抗原的定位。但有非特异性吸