荧光定量原理与应用(第三版)PPT.ppt

实时荧光定量PCR技术与应用;定量PCR;PCR反应混合物;荧光曲线;定量原理;Ct值的概念;; How are these amplifications reported?;108;106;104;108;108;;108;; 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。 ;首先确定未知样品的 C(t)值 借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量;为什么要用Ct值定量;;;与传统PCR的比较;提纲; SYBR Green 1;SYBR Green I;SYBR Green I 工作原理;;;;;Melt Curve Analysis;Melt Curve Analysis;Melt Curve Analysis;SYBR Green I 优点;SYBR Green I 缺点;提纲;多重PCR;内参照基因;多通道技术; 1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰 2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行 2、模板量差别---共用资源的相互竞争;提纲; 绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相对标准曲线 不使用标准曲线，利用Ct值计算 ΔCt方法 ΔΔCt方法（看家基因） Pfaffl方法（考虑扩增效率） Vandesompele方法（多看家基因）; 利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响 ;表达差异;材料和方法;提纲;Temperature increases;荧光强度的倒数取负数后对温度作图(-dI/dT);溶解曲线的作用;产物特异性分析;10,000 copies;10,000 copies; 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度;利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化;45oC;提纲;实时荧光定量PCR应用;定量PCR应用I-实时定量;定量PCR应用II：终点读板;感谢各位光临！