荧光定量PCR原理、应用及Stratagene Mx3000P介绍9.22PPT.ppt

软件的结构 PCR板的设定 PCR程序设定 运行时的状态 实时扩增数据 软件自行优化的数据分析 Adaptive baseline correction Amplification-based threshold 标 准 曲 线 相对定量Results Display 4 fold down 3 fold up 基因分型结果显示 User defined genotypes, color coded populations, and automatic calling on text report “只读板”实验结果 结果文本显示 Text Report or raw data can be exported to Excel or a text file Customize report 多种格式输出结果 Text Report Excel spreadsheet PowerPoint presentation Any screen shot 检测策略 抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆总量 应用之四：GMO检测 数据处理： C（t）EPSPS-C（t）Lectin＝△C（t） %GMO＝（1+E） ? Ct 荧光定量PCR仪的硬件条件 激发光源 热循环－加热、制冷 样品 检测设备 荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性. 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 Stratagene’s New Mx3000P! High Performance Personal Price Stratagene 公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧洲与日本设有分公司. Stratagene 公司简介 Mx3000P 整体设计 热盖 热循环系统 石英卤钨灯 发射光滤镜轮 激发光滤镜轮 光纤扫描臂 Mx3000P 热循环系统 96 孔样品槽 半导体加热制冷 温度均一性: +/- 0.25°C 升降温速率: up to 2.5°C/sec 热循环系统 半导体加热制冷 resistive and convective heat exchange 独特的温度补偿条，整板温度均一性 +/- 0.25°C 热盖 反应体积10-100ul Mx3000P 光路系统 PMT 96 well plate 石英卤钨灯 激发光滤镜轮 发射光滤镜轮 扫描式检测 同轴光纤 Mx3000P 光学系统 石英卤钨灯(350-750nm) 2 个滤镜轮 可选择的滤镜: Filter sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VIC, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy3 1 PMT（光电倍增管）检测器 350-700nm 发射光检测范围 扫描式检测设计 Mx3000P 扫描系统 整板扫描3.5s 滤镜轮旋转进行多通道扫描 激发光源的比较 Lasers: 光强高, 波长范围窄； 石英卤钨灯: 中等光强, 波长范围宽； LED: 光强低, 波长受限制。 Halogen Lamp Laser LED Alx350 FAM TET HEX JOE ROX Cy5 Cy3 TAM TxRd Mx3000P 可用荧光染料 发射光滤镜 发射光滤镜 荧光滤镜系统 Ex. Filter 350 nm 750 nm 10 nm Interference Mx3000P 四通道设计，避免光谱重叠 Mx3000P 发射光滤镜轮 荧光检测系统的发展 PMT光电倍增管 冷CCD CCD Photodiodes光电二极管 荧光检测系统灵敏度比较示意图 PMT (光电倍增管) 冷 CCD CCD Photodiodes光电二极管 PMT与CCD的检测原理 hv hv e- e- PMT CCD CCD与PMT检测区别 无边缘效应 边缘效应 CCD Mirror Simultaneous Illumination/Detection CCD与PMT检测结果均一性对比 Ct vs. Well number (across plate groupings) Mx3000P均一性实验 96 well uniformity run. SYBR Green I detection 9