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实验八 RTPCRRT实验
实验八 RT-PCR——(1)RT实验;二、RT-PCR的基本原理
RNA是一类极易降解的分子。首先RNA在逆转录酶作用下反转录为cDNA第一链:脱氧核苷酸引物与mRNA杂交,在RNA依赖的DNA聚合酶指导下合成互补的cDNA序列;
然后在DNA聚合酶的作用下扩增目的基因:PCR第一个循环由正义引物(oligo-dT)和cDNA第一链退火结合,在DNA依赖的DNA聚合酶指导下合成第二链,从PCR第二循环起开始扩增目的片段。 ; TakaRa RT-PCR 试剂盒(AMV装)概述
本试剂盒适用于各种RNA制品(包括RNA病毒)的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用AMV (禽源的)进行反转录反应,能够获得较长的反转录产物,约1-2kb。
同时,在10μl反转录体系,50μl PCR反应体系中,还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续克隆实验。 ;三、实验仪器、材料与试剂
仪器
1. 200℃以上烘箱
2. 低温离心机
3. 恒温水浴锅
4. 微量移液器
材料
试剂盒组成及包装; 100次
反转录酶(AMV:5U/μl ) 50μl
RNAse Inhibitor(40U/μl ) 25μl
Random 9mers (50pmol/μl ) 50μl
Oligo dT primer(2.5pmol/μl) 50μl
RNase Free ddH2O 1ml
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl) 40μl
M13 Primer M4 (20mol/μl) 50μl
10×RT Buffer 1ml
5×PCR Buffer 1ml
dNTP Mixure(各10mM) 150μl
MgCl2 ( 25mM ) 1ml
; 四、操作步骤 ;五、注意事项
吸取试剂盒中的dNTPs时,请用DEPC 处理过的Tips。
-20oC冻存,有效期12个月。
RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备
;逆转录酶和逆转录反应:在一般的逆转录反应中,较常用的是MMLV(鼠源的)和AMV(禽源的)两种,现在更有各家公司推出的耐热的(50-60度)、超长片段的逆转录酶,这方面具有专长的数gibco(现在并购于Invitrogen)
AMV有其自身的优点,酶的活性很高,扩增1kb以下的基因时比较常用,临床上血液检测中有时使用AMV,省时,也省试剂。;六、实验结果与讨论;附I:常用的RNA酶抑制剂
焦碳酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
;氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。;附II: TRIZOL试剂
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。;在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
TRIZOL是有毒物,接触皮肤或者不慎吞服,会导致灼伤,一旦接触皮肤后立即以大
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