生物化学和分子生物学2PPT课件.ppt

课件地址 0 --本科生课件 ------公选课 用户名:biox 密码:ustc RNA interference(RNAi) 基因表达调控的基本概念 基因表达的方式 组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression） 组成性表达： 适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)； 相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。 基因表达的规律 ——时间性和空间性 时间特异性（temporal specificity） 基因表达调控的生物学意义 适应环境、维持生长和增殖（原核、真核）  维持个体发育与分化（真核） RNA干扰的基本原理 RAN干扰的发现实验 RNA干扰的细胞生物学途径 外源或内源产生的dsRNA进入细胞后，在核酸酶(Dicer)作用下被切割成3 端有2个碱基突出的21～23 nt长度的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)； 这些siRNA与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNA—induced silencing complex，RISC)；而后RISC在siRNA反义链的指导下与siRNA 同源靶RNA相结合，并在近中点位置将其切割，达到抑制靶基因表达的作用 RNAi是指将外源双链RNA(double—stranded RNA，dsRNA)导人细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA 降解的现象，属于转录后基因沉默 (post—transcriptional gene silencing，PTGS)的一种形式。 RNA 干扰的应用 基因功能研究 基因治疗 RNA干扰技术应用于哺乳动物细胞的研究策略 在哺乳动物细胞中，长dsRNA(通常大于30 bp)导入后，会启动细胞内的病毒防御机制，细胞内干扰素产生加大，RNA依赖的蛋白激酶被激活，使翻译起始因子elF2a磷酸化，致使细胞内全部蛋白合成的关闭；同时RNA酶L(RNase L)被激活，产生非特异性mRNA的降解，最终诱导细胞凋亡。 上述因素在一段时间内限制了RNAi在哺乳动物细胞中的应用。2001年Elbashir等首次采用体外合成的21 nt siRNA导入到人胚肾细胞和人宫颈癌细胞(HeLa)，观测到RNAi现象的发生。此后RNAi技术在哺乳动物细胞中的探索与应用逐渐成为研究热点。 RNA干扰技术应用于哺乳动物细胞的研究策略 在哺乳动物细胞中开展RNAi实验大致包括以下5个步骤： 选取目的基因； 设计相应的siRNA序列； 制备siRNA； siRNA转染哺乳动物细胞； RNAi效果分析。 RNAi研究的一般技术路线 治疗HIV 感染 由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。 针对HIV病毒研究有Jacque等设计的抑制HIV 1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA，Lee等针对rev转录子设计的siRNA及Novina等针对HIV病毒gag基因设计的siRNA，其基本策略都是选择HIV病毒基因为靶点。 治疗HIV 感染 然而，RNAi治疗HIV，应用于临床，有几个重要问题必须解决： Ａ、作用靶点的选择，siRNA对序列要求非常严格，1个碱基的错配，将大大降低siRNA基因表达抑制作用。如果HIV逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核苷酸每个复制循环)，就可能迅速导致所谓siRNA逃逸突变的出现。感染个体中HIV序列的多样性，为siRNA的设计和合成增加了难度。 Ｂ、如何有效导入siRNA. DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞中效果较差。 Ｃ、增强siRNA在细胞中的稳定性.为了防止细胞内RNA酶对siRNA的降解，可以用DNA质粒和病毒载体将siRNA以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。 治疗肝炎病毒感染 Jude Lieberman等已经成功地利用 RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。 他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（FAs）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。 据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。 Jude Lieberman等给实验