海桑属红树植物基因多态性分析.pptVIP

红树植物多糖含量较高，可能严重影响后续试验。通过用缓冲液A对植物组织进行预处理，预先去除大量的多糖，以达到提取高纯度DNA的目的。 巯基乙醇的作用：由于植物中含有大量多酚类物质，容易与DNA形成不溶性沉淀，造成DNA的损失；此外多酚类物质是氧化性物质，在溶液中形成氧化环境，易引起DNase对DNA的降解，在溶液中加入巯基乙醇以形成还原性环境，避免DNase的作用。 酚-氯仿抽提：酚是有效的蛋白质变性剂，可以去除蛋白，但核酸提取过程中常采用酚和氯仿的混合液，这是因为：两种不同有机溶剂较之单一使用一种效果更佳，而且可以避免酚造成的核酸损失。接下来，在使用酚-氯仿后需用氯仿再次抽提主要是为了防止溶液中痕量酚对于后续操作中酶的影响。 植物组织（细胞）磨碎后经裂解液裂解；蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除；然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于硅膜，再通过一系列漂洗－离心步骤, 进一步将多糖、多酚和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅膜上洗脱下来。 简化了繁琐的有机试剂抽提步骤，减少了环境污染和操作损失，操作要求低，重复性好； 彻底去除可能抑制后续操作的抑制物（如乙醇、有机溶剂），提高产物稳定性； 高效快速，易于自动化； RB1 (Resuspension Buffer 1) 重悬缓冲液 重悬并裂解细胞，变性核蛋白体，释放核酸 RNase A RNA酶A 降解RNA，去除RNA干扰 PB1 (Precipitation Buffer 1) 沉淀缓冲液 沉淀细胞碎片、蛋白、多糖等杂质 BB1 (Binding Buffer 1) 结合缓冲液（已加入乙醇） 作用于核酸表面水化层，通过电荷作用力促进核酸结合于硅膜 CB1（Clean Buffer 1）清洁缓冲液 去除未能结合于硅膜表面的杂质、盐分等 WB1（Wash Buffer 1）漂洗缓冲液（已加入乙醇） 去除以弱离子力结合的杂质、盐分等，消除高盐环境，纯化产物 ddH2O(无菌双蒸水) 洗脱核酸 制备管（含硅质膜） 收集洗脱废液 取新鲜植物组织100mg 在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉； 转移细粉至一个1.5ml 离心管，加入250μl 缓冲液 RB1和15μl Rnase A ，旋涡振荡，充分混匀以助裂解； 55℃水浴15分钟，在水浴过程中颠倒离心管 2 -3 次，混合样品； 12000 rpm离心5min，轻轻吸取上清至另一洁净1.5ml离心管； 加入100 μl 缓冲液 PB1，充分混匀，冰浴 5 分钟， 12000 rpm 离心5 min，小心吸取上清至一新的1.5ml 离心管，避免扰动和吸取界面物质； 加入375 μl缓冲液BB1，充分混匀；（加入BB1可能出现絮状沉淀，但不影响 DNA提取） 取全部混合液（包括可能的沉淀）加入吸附柱中，（吸附柱放入收集管），1 2 000 rpm 离心30 sec，弃去收集管中废液； 吸附柱容量有限，先加 650μl 溶液离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心 在吸附柱中加入500μl 清洁液CB1，12,000 rpm 离心30sec，弃废液； 在吸附柱中加入500μl 漂洗液WB1，12,000 rpm 离心30sec，弃废液；并重复本步骤一次； 将吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 离心2 分钟，彻底去除残留的WB1，以免其中残留乙醇影响后续操作； 取出吸附柱，放入一洁净1.5ml离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl 双蒸水（事先在 60℃水浴中预热）， 室温放置1分钟，12000 rpm 离心1 分钟，获得基因组DNA溶液； 取5μl DNA溶液，以1.0%agarose 电泳检测，剩余DNA 保存于-20℃中，作为PCR扩增模板； 基因组DNA质量可通过琼脂糖电泳初步检测： 基因组DNA片段应在20kb－30kb之间； 高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象。 移液器的使用 选择合适量程 2个档位 保养与维护 离心机的使用 配平 时间配合 基于DNA的半保留复制原理，通过温度变化控制模板变性、引物退火和引物延长的多个循环来扩增特异DNA序列的过程，上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使得扩增呈指数增长，因而可作为核酸检测的一种非常灵敏的技术。 Predenatue 90-95 ℃ 3-5min Denature（90℃-96℃） 双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 30 sec-1min Anneal（25℃-65℃） 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链 30 sec-1min depends on the duplex Extension（70℃-75℃） 在Taq酶的作用下，以dNTP为