蛋白质之间相互作用.pptxVIP

蛋白质相互作用; ;通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知的诱饵蛋白, Y可以是单一已知蛋白或者文库蛋白或者未知蛋白），在GAL4?UAS和启动子的下游构建了3个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用 ;若X、Y相互作用，BD、AD间接连接，AD靠近转录起始位点激活下游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报告基因不表达;优点 1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 ;局限性 1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录