同种异体骨移植修复过程中转化生长因子1表达的实验研究课件.ppt

;前 言; 本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因素对移植骨局部内源性TGF-β1表达的影响，旨在为进一步研究异体骨移植愈合机理以及临床合理使用重组生长因子提供实验依据。 ;材料与方法;表1：实验动物分组情况及处理; 四、动物模型建立 LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml /kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨， 造成股骨干中段3mm×4mm大小的骨缺损模型。 将移植骨正位植入后，逐层缝合伤口。 ; 五、主要试剂 TGF-β1免疫组化试剂盒及TGF-β1原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程公司提供）。 ;; 将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照，以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以空白对照实验的染色程度确定是否阳性, ≤空白实验染色强度为阴性,空白对照染色强度为阳性。阳性表达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标准。以乳腺癌标本作为阳性对照。; 七、图像分析和统计学方法 1．骨组织形态计量分析 每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系统计算新生骨组织密度。 新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨面积。 2．TGF-β1原位杂交结果图像分析 将原位杂交组织切片随机选取 5个视野，经计算机自动图像处理系统提取图中表达阳性信号彩色阈值，计算平均光密度值。; 以上数据统计学处理采用SAS软件，进行2×2×4析因方差分析。 数据以均数±标准差表示，P﹤0.05有显著性差异。;结 果; ※ 主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植： ⑴ 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。 ⑵ 术后第2周，移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现且位置表浅，髓腔内有残余骨小梁。 ⑶ 移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。 ; ※ 主要组织相容性??原不配的新鲜异体骨移植： ⑴ 骨吸收活跃，且移植骨周围有大量多核巨细胞浸润。 ⑵ 术后2周， 移植骨边缘及髓腔内有少量新生骨样组织出现；至8周时，新生骨组织很少，移植骨内仍有大片均质状死骨。髓腔无再通迹象。 ⑶ 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。; ;;图 5．术后1周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（ISH ×100） 图 6．术后1周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（ISH ×100） 图 7．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（ISH ×100） 图 8. 术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（ISH ×100） ; 图 9 图 10 ; 1．随时间延长新生骨组织密度逐渐增高，术后第8周新生骨组织密度最高（P﹤0.05）。 2．主要组织相容性抗原相配与不配者之间新生骨组织密度有显著性差异（P﹤0.05）。; 3．冷冻异体骨移植与新鲜异体骨移植之间新生骨组织密度有显著性差异（P﹤0.05）。 4. 主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植新生骨组织出现最早，成骨效果最好，术后8周与其他各移植骨相比新生骨组织密度最高（P0.05）。;;;;; 影响因素 F值 P值 主要组织相容性抗原(A) 1277.55 0.05 移植骨处理(B) 71.19 0.05 术后观察时间(T) 449.16 0.05 A×B 887.30 0.05 B×T 67.89 0.05 A×T 393.78 0.05 A×B×T 30.99 0.05; 1 2 4 8;; 本