实验八聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳课件.ppt

实验八;目的与要求 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质的原理； 熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术。;实验原理;水平板式电泳槽;电泳分离原理;聚合反应是由溶于水的AP产生自由基S2O8-→SO4-自由基SO4-，催化TEMED使之成为带不成对电子的活化分子，活化的TEMED可随机与Acr分子或Bis分子结合并转移自由基使之活化。被活化的Acr可以同样的方式结合另一分子Acr并转移自由基使其活化，如果反应物中只有Acr分子，按反应机理可以使所有Acr分子结合成长链，使其末端的Acr分子始终带有被转移的自由基活性，但仅Acr分子的多聚体只能形成长链，尽管呈黏稠状，但不能形成带孔的凝胶。;Bis是由两个Acr分子靠甲叉基相互连接构成。Bis中的两个丙烯酰胺都可以分别被TEMED活化成为活化分子，而后又去不断地结合和活化其他Acr分子，形成长链；或者分别被已形成长链的Acr活化连接；或者一边被TEMED活化后与Acr形??长链，另一边与已合成的Acr长链结合等，其反应是随机的，多样的，但无论如何反应，在形成的Acr长链之间由于Bis的纵链而被连接起来，形成立体的网状结构。Bis是一种引入纵链的交联剂。这样，按一定比例的Acr和Bis在TEMED、AP的作用下就形成具有立体多孔、多分枝网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。;丙烯酰胺（Acr） 交联剂: 甲叉双丙烯酰胺（Bis）催化剂: 过硫酸铵（化学法） 核黄素 (光化法） 活化剂: TEMED （N，N，N’，N’-四甲基乙二胺);不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳;浓缩效应 ;电荷效应;分子筛效应 ;聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系;考马斯亮蓝 Coomassie brilliant blue ;试剂及器材;实验操作;4、待约30min即凝集成胶，弃去顶上水层，可用吸水纸吸干。 浓缩胶： 1、按表配制浓缩胶：在干燥小烧杯中先加入4,5,7号液分别为1ml、2ml和4ml，混匀。 2、再加入6号液1ml混匀，用少量该胶液冲洗分离胶面，然后用吸管吸取该胶液沿壁灌入分离胶面上层距管口约0.5cm处。 3、迅速小心沿壁加入水层，置胶管于日光灯下照射，进行光化作用，约30min后聚合完全。 待胶凝好后，将封闭物取下，将胶管安到电泳槽中，倒上缓冲液，检查是否漏液，液面要过管顶。;点样：取血清100μl，40%蔗糖100μl，溴酚蓝100μl于白磁盘中混匀，上样15μl。 电泳：浓缩胶时电压80V（约40min）,分离胶160V(约3h)。 待溴酚蓝快到管口时停止电泳，倒出缓冲液。 取胶：带长针头的注射器吸水，沿管壁慢慢插入同 时注水，慢慢转动，胶会慢慢滑出或用洗耳球吹出于试管中。不要用力过猛，且试管应先放些水，以防止胶断裂。 染色：将试管里水倒掉，加入染色液，染色40min。 脱色：倒出染色液，加入脱色液，更换3次脱色液每次脱色10min，然后隔一天换一次脱色液，直到蛋白带清晰为止。;注意事项 1.丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性，尽量避免吸入和接触。 2.考马斯亮蓝染色、脱色，染液回收。 3.电泳注意正负极。