基因定位常用的方法PPT.pptVIP

第四节 基因定位常用的方法 Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因定位于1 号染色体上,是人类首次在常染色体上进行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用，基因定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促进了基因定位的进程。 基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的认识有重要意义。 明确几个基本概念 基 因：DNA的功能片段。 基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因 外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的总和。 基因定位：是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。 遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。 染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。 一、基因定位的方法 1、体细胞杂交法基因定位： 体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。 1）体细胞杂交的概念： 也称细胞融合（cell infusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell），含双亲不同的染色体。 2）对象： 人的细胞 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠 3）杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。 HAT选择系统： 人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料 因此在HAT培养基上 人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍） 鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成） 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。 鼠 人 X TK- HPRT+ TK+ HPRT- 鼠 人 鼠 人 鼠 人 TK+ HPRT+ 17 3 17 3 17 3 TK+ TK+ TK- HAT ②克隆嵌板法(clone panel method) 根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因定位方法。 克隆嵌板 杂种克隆 保留的人染色体 1 2 3 4 5 6 7 8 A + + + + - - - - B + + - - + + - - C + - + - + - + - 2.原位杂交和荧光原位杂交 1）原位杂交（in situ hybridization）：是最直接的基因定位方法之一