基因工程第二章 DNA重组的克隆操作PPT.ppt

2 DNA重组的单元操作;基因工程载体必需具备的4个基本条件;2.1 DNA重组的载体;2、可扩增性;4、质粒的转移性;（二）理想质粒载体的必备条件;三、质粒载体的构建;2 特点;3 重组克隆的 “插入失活”筛选方法 ;Amp r;四、常用的质粒载体;可用组化方法鉴别：;;（二）表达质粒载体;例：pBV221 （1）利用λ噬菌体的PL、PR作为串联启动子。一个温度敏感的转录阻遏蛋白cI857基因位于其上游。 （2）在多克隆位点的下游有一强转录终止序列rrnB。 （3）在多克隆位点与启动子之间有SD序列。;（三）多功能质粒载体;（四）穿梭载体;2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体;GGGCGGCGACCT; λ噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据 。;人为地将λ噬菌体基因组分为3个区域： （1）左侧区，自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。 （2）中间区：介于基因J与基因N之间，又称非必需区。 （3）右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。;（三） λ噬菌体的DNA复制;二、构建λ噬菌体载体的基本原理;（二）构建λ噬菌体载体的基本内容;三、常用的λ噬菌体载体;（二）取代型载体;2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体;一、M13噬菌体的生物学特性;（二） M13噬菌体复制、感染和包装;+;一、黏粒载体的基本特点;;2.1.5 人造染色体载体;2.2 DNA的体外重组（切和接）;限制与修饰系统的作用：;宿主细胞对噬菌体感染的限制-修饰作用;（二）限制性核酸内切酶的类型;（2）Ⅱ型限制性核酸内切酶 ;（三）限制性核酸内切酶的命名;（四）II类限制性核酸内切酶的基本特性;2. II型限制性核酸内切酶的切割方式;（2）平端;来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 如：HpaⅡ和MspⅠ，它们的识别序列均为CCGG，切割位点均为C↓CGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ和MspⅠ均可对其切割，如果胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶CmCGG，则MspⅠ可以切割它，而HpaⅡ就不能切割此序列。 ;同尾酶 ;（五）甲基化酶的基本特征;2.2.2 DNA连接酶;催化连接反应步骤； （1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP复合物，同时释放出焦磷酸基团（PPi）或烟酰胺单核苷酸（NMN）。 （2）激活的AMP结合在DNA链5′端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键。 （3）与相邻DNA链3′端羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。;DNA连接酶的作用机制图;DNA连接酶只能连接DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，不能连接裂口。;二、DNA连接酶的种类;AATTC· · · · · · G;2.2.3其他用于DNA重组的工具酶;2、5′→3′外切酶活性 ;水解作用的三个特征：;3、3′→5′外切酶活性 ;5’;二、Klenow片段;在使用Klenow片段进行末端标记时，DNA片段应具有3′凹陷末端。;2.2.3.2 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）;TdT 作用的底物性质;2.2.3.3 S1核酸酶;2.2.3.4 Bal31核酸酶;3′;2.2.3.5 T4噬菌体多核苷酸激酶;1、正向反应;2、交换反应;2.2.3.6 碱性磷酸酶;用碱性磷酸酶防止载体自身环化;三、T4-DNA聚合酶;2.2.4 DNA切接反应的影响因素;限制性内切酶的星号活性：第II类限制性内切酶虽然具有特异的识别序列及切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列。 如:EcoRI正常条件下识别5 ′-GAATTC-3 ′序列，但在低盐、高pH和甘油大量存在的情况下，其识别序列除原来的序列外，还包括5 ′-AAATTC-3 ′和 5 ′-GAGTTC-3 ′等。 ;2.2.4.3 重组率及其影响因素