基因工程第三章克隆载体-1PPT.ppt

* * 第三章 基因克隆载体Chapter 3 Gene Cloning Vector 1/32 计划学时: 4h 第一节 质粒载体 (plasmid vector) 第二节 病毒载体(virus vector) 第三节 染色体定位整合载体(chromosome position fixing vectors) 第四节 酵母人工染色体载体 (YAC vector) 第五节 特殊用途的载体 2/32 克隆载体的定义 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。 3/32 载体的特点 有多克隆位点,供外源DNA插入。 多克隆位点(multiple cloning site, polylinker): 具有多个限制酶的识别序列,可供处源DNA片段插入. 携带外源DNA进入受体细胞(receptor cell, host cell)，并能自我复制。 有选择标记基因(marker gene),例如：抗抗生素基因。 载体要安全，对受体安全，不能转入其他生物，尤其人细胞。 4/32 The essential nucleotide sequences of cloning vectors: A replication origin, A drug-resistance gene, Multiple cloning sites. 复制起始位点 抗氨苄青霉素基因 多克隆位点 5/32 质粒载体 (Plasmid vector): 以质粒DNA分子为基础构建(construct)而成的克隆载体。 构型: 超螺旋 supercoil Relaxed DNA Supercoil DNA 7/32 1.2 质粒的大小 天然质粒:1kb~100kb 质粒载体较小, 有的只有3kb, 具有作为载体的必须序列即可。 200kb 3kb 8/32 1.3 质粒的复制 Replication 每次细胞分裂，质粒均可复制传给子代细胞。 一般，细胞中质粒的拷贝数保持稳定。 9/32 松驰型质粒：拷贝数多，小质粒。 严紧型质粒：拷贝数少，大质粒。 200kb 5kb 10/32 1.4 质粒的不亲合性 能寓于同一细胞的质粒为亲合性质粒 不能寓于同一细胞的质粒为不亲合性质粒。 布什 本.拉登 布什 布莱尔 受体细胞最好无内源质粒. 11/32 1.5 质粒的迁移性 接合质粒：含有 tra基因，可连接宿主细胞和受体细胞，并在两者间转移。 特点: 大，拷贝数少，宿主多，不安全。 非接合质粒：无tra基因， 特点: 小，拷贝多，宿主少，安全，常用载体。 接合质粒 染色体 12/32 隐蔽质粒：引入后，受体细胞的遗传特性无变化。 显性质粒：引入后，为受体细胞提供了新的遗传特性。 如：抗抗生素，颜色变化等。 1.6 显性质粒与隐蔽质粒 13/32 2 质粒载体的构建 2.1 选择合适的出发质粒，并用限制酶切开。 好的质粒应具备： 复制起始位点（Replication Origin，Ori） 标记基因（Marker gene ） 多克隆位点（Multiple cloning site ） 启动子（Promoter ） 终止子（Terminator） 14/32 多克隆位点 标记基因 Ori 启动子 终止子 EcoRI 合适的质粒 15/32 2.2 获得合适的DNA片段. DNA也要用限制酶切开，有两个粘性末端。 易于DNA ligase连接. 16/32 2.3、重组连接 混合酶切后的DNA片段和载体，加入DNA ligase催化连接。 17/32 质粒克隆60 18/32 3 Ti 质粒载体 Ti 质粒: 农杆菌中可引起寄主产生肿瘤的质粒。 Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 19/32 3.1 Ti质粒的组成（4个功能区） （1）T-DNA Ti质粒中能转移进入植物细胞内的DNA片段。长约20kb， 包含冠瘿碱合成和冠瘿瘤生长基因 20/32 T-DNA的结构特征： T-DNA区两端具有25个碱基对的顺向重复序列称为边界序列。 21/32 右边界序列更重要。 去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对无明显影响。 22/32 Left border right border 只要保留边界序列， T-DNA的其它序列被外源DNA片段替换，仍可转入植物基因组。 23/32 * * * * *