基因工程原理-第3章基因克隆载体PPT.ppt

第七次课结束！ 4. TA载体 T T A A 5. 质粒表达载体 ——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。 lac启动子表达系统 质粒表达载体 融合型表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图 融合蛋白表达载体： 融合蛋白：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转移产生的单一的多肽序列。 表达融合体蛋白质策略的优点： （1）克隆的外源基因能有效转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。 非融合蛋白表达载体： 二、噬菌体克隆载体 λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。 相关概念： 溶菌生命周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒后，使寄主细胞破裂，释放出来的过程。 溶原生命周期：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制的过程。 温和噬菌体：能进入溶原周期和溶菌周期的噬菌体。 烈性噬菌体：具有溶菌生命周期的噬菌体。 溶原性细菌：带有温和噬菌体的细菌。 溶原性噬菌体的生命周期 a：噬菌体吸附到寄主细胞表面； b：噬菌体DNA注入寄主细胞； c：噬菌体大量增殖 d：子代噬菌体颗粒组装； e：寄主细胞溶菌； f：噬菌体DNA从寄主染色体DNA上删除下来； g：溶原性细胞按照正常速率分裂。 1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质 基因按功能相近性聚集成簇： 左侧区：A-J，合成头尾蛋白的全部基因 中间区：J-N，非必要区，与重组有关 右侧区：N-R，DNA合成及调控。 G+C=10 A+T=2 cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点 线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5单链突出序列，即粘性末端。注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5—P和3—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。 2. λ噬菌体作为构建克隆载体的依据 λ噬菌体是一种温和噬菌体 能承载比较大的外源DNA片段 存在多个限制性位点 3. 构建λ噬菌体克隆载体的基本策略和路线 用限制酶切去λDNA上的非必需区 在λDNA的非必需区内组入选择性标 构建重组λDNA分子体外包装系统 噬菌体的包装： 体外包装：在离体条件下，用噬菌体或病毒的蛋白质包裹噬菌体或病毒的裸核酸，组装成有感染性的噬菌体或病毒颗粒的过程。 λDNA分子体外包装系统的建立 E基因：λ噬菌体的E基因编码头部基因的主要成分（占头部总蛋白的70%） D基因：λ噬菌体的D基因也编码头部蛋白，但主要与λDNA进入头部和头部的成熟有关（占20%） 4.λ噬菌体DNA的包装限制问题 包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为51kb-28kb=23kb。实际为15kb。 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。 转染作用（transfection）：寄主细胞捕获噬菌体DNA 的过程。或重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。 转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程。 转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过程。 5.λ噬菌体克隆载体的应用 ——构建cDNA文库 细菌质粒载体：是以细菌质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，主要用于外源基因片段的转移、贮存、表达以及基因文库的构建等。 三、Cosmid载体（cos site-carrying plasmid） （一） Cosmid载体的特征 环形双链DNA分子，大小一般在10kb以下 具有质粒的性质 含有一个cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点 能承载较大的外源DNA片段 ——一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 克隆能力：31—45kb pBR322 （6524bp) λDNA：cos序列和控制包装序列 pBR322 质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区 （二） Cos