植物基因工程育种PPT.pptVIP

6.花粉管导入法 基因枪法（微弹轰击法） 工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。 动力类型：火药爆炸力； 高压气体； 高压放电． 操作步骤 （1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3） DNA微弹轰击； （4） 培养轰击后的外植体． 转化率影响因素 金属微粒 金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵. DNA沉淀辅助剂 这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害. DNA纯度及浓度 微弹速度 植物材料内在因素 根癌杆菌介导法 根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型。在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。 1　Ti质粒的改造策略 Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍： （1） 质粒过大，造作困难 （2）大型的Ti质粒有多个酶切位点 （3）植物激素类的影响 （4） Ti质粒中存在不起作用的序列 （5） Ti质粒的局限性 为了使Ti质粒变成操作简便且有效的外源基因转移载体,必须对野生型的Ti质粒进行改造.植物转基因有一元载体系统和二元载体系统,所以采取不同的改造策略. 二元载体较一元载体的优点: 构建比较方便; 二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中. 2　根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理 6个步骤： 1）农杆菌对受体的影响 （2）农杆菌附着到植物受体细胞 （3）诱导启动毒性区基因表达 （4）类似接合孔复合体的合成和装配 （5）T-DNA的加工和转运 （6）T-DNA的整合 3。T-DNA转移的影响因素 （1）农杆菌菌株 （2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 （3）基因活化的诱导物 （4）外植体的类型和生理状态 （5）外植体的预培养 （6）外植体的接种及共培养 基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较 (1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默表达。 农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合）转 化 效率较高。 (2）基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制。 农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。 （3）基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。 转基因操作的受体系统 1、高频再生体系的建立 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞再生系统 2、抗生素敏感实验 抑制细菌生长 杀死非转化细胞 3、农杆菌敏感实验 转化细胞的培养和转基因植株的再生 恢复生长 筛选培养 植株再生 转化子细胞的筛选 当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化，只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选择到转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。转化筛选细胞的方法主要有两种：一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（ 如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。 转基因植物的鉴定 遗传鉴定 表达鉴定 表型分析鉴定 利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交 直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交） 鉴定步骤： 筛选鉴定（利用质粒上的选择标记） 报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因） 遗传鉴定 生长试验 DNA鉴定- southern RNA鉴定- northern 蛋白质鉴定- western 一、植物基因工程中的选择基因 植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。 1、新霉素抗性基因（neor）