第14章基因重组和基因工程--本科PPT.ppt

λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 线性双链DNA分子，大小约50kb。 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 柯斯质粒载体 (cosmid vector) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 3.其他 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 二、重组DNA技术基本原理（??） 目的基因的获取 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 已知目的基因的核苷酸序列 已知基因产物的氨基酸序列 。 化学合成法 推导出编码基因核苷酸序列 化学合成仪 合成目的基因 一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰岛素原、 干扰素基因等。 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 以mRNA为模版，反转录合成cDNA ，与载体拼接后导入受体菌，即获得cDNA文库。由总mRNA 制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的基因。目前发现的多数蛋白质的编码基因都是如此分离的。 从cDNA文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T （二）克隆载体的选择和构建 外源DNA片断离开染色体是不能复制的，必须借助载体，随载体的复制而复制，重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术型的专门工作，目的不同、操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接 粘性末端连接 即DNA的体外重组，靠DNA连接酶将外源基因与载体共价连接，其连接方式主要有： 1）同一限制酶切位点连接 2）配伍末端连接 2、平端连接：非配伍粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3、同聚物加尾连接 在末端转移酶作用下，在DNA片断末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，而后进行粘性末端接。 4、人工接头连接 对平端DNA片断或载体DNA可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端，使产生新的酶切位点，再用识别新位点的限制酶切割，产生粘性末端，这也是粘性末端连接的一种特殊形式。 （四）重组DNA导入受体菌 外源DNA(含目的DNA)与载体在体外连接成重组DNA分子后，需将其导入受体细胞(形成转化子)。随受体细胞生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖。 受体菌条件： 1）容易接纳重组分子 2）对载体的复制扩增无严格要求 3）不存在特异的限制-修饰酶体系降解或修饰 外源DNA 4）符合“重组DNA操作规则”的安全标准。 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 （五）重组体