第二章 基因工程制药PPT.ppt

第二章 基因工程制药;第一节 概述;传统的制药方式很难生产具有内源生理活性的药物或疫苗。; 可用于医药目的的蛋白质或活性多肽都是相应的基因合成的。 基因工程技术分离基因、体外操作，生产出比原来多成百上千倍的蛋白质。;利用基因工程技术生产药品的优势： （1）利用基因工程技术可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用建立有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程可以发现更多的内源活性物质； （4）内源生理活性物质在作为药物使用时，存在的不足可以通过基因工程和蛋白质工程技术加以改造； （5）利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。;一、基因工程药品的实验室研究阶段;2.综合调查及理论证实 （1）??查研究状况、专利情况、与现有药物相比的优缺点等，对该生物药物的适应症、作用机理、应用前景得出结论。; 列入研究计划的项目，生物公司将发动不同领域的专家参与研究： ①生物信息学专家：资料的收集与分析； ②细胞生物学家：建立细胞模型； ③生物化学专家：建立表达和纯化蛋白质的方法； ④动物药理学和病理学专家：建立动物模型，进行动物实验；;二、基因工程药品的开发阶段;2、优化的先导物动物实验，再灵长类动物体内实验 ①系统研究药物学、药物代谢动力学、药效学、毒理学； ②保证待选药物有较好的生物利用度和一定的抗代谢和排泄能力，确保药物分子在作用位点维持足够长的时间； ③为最后的剂量的确定做重要的准备。; 研究和开发阶段应完成项目： 产品的制备工艺、理化性质、纯度、检验方法、剂型、稳定性、质量标准、药理、毒理、动物药代动力学等研究。;三、基因工程药品的临床实验;II期临床试验：治疗作用初步评价阶段。目的是初步评价药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性，也包括为III期临床试验研究设计和给药剂量方案的确定提供依据。（最低100例） III期临床试验：治疗作用确证阶段，目的是进一步验证药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性，评价利益与风险的关系，最终为药物注册申请的审查提供充分的依据。（最低300例）;Ⅳ期临床试验：新药上市后由申请人进行的应用研究阶段，目的是考察在广泛使用条件下的药物的疗效和不良反应、评价在普通或者特殊人群中使用的利益与风险关系及改进给药剂量等。（最低2000例）;四、新药申请和上市;五、基因工程药物的生产;第三节 目的基因（制药基因）的获得;1.mRNA的纯化;2.cDNA第一链的合成;（2）随机引物引导的cDNA的合成 随机合成6-10个寡聚核苷酸片段作为合成第一链cDNA的引物，采用混合引物后，cDNA的合成可以从mRNA的许多位点同时发生。;（3）基因特异性引物引导的cDNA合成法 RNA序列或部分序列已知，可通过设计基因特异性引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA第一链。;(1)自我引导合成法 先通过RNA酶消化mRNA模板，从而导致第一链cDNA的解离，并在其末端形成一个发夹结构，将这个发夹结构作为合成cDNA第二链的引物，形成完整的cDNA第二链，最后发夹结构用S1核酸酶切除。;(2)大肠杆菌RNA酶降解取代法 反应最后RNA分子仍余靠其5末端的极小部分。;4.cDNA克隆; 作为基因工程的载体，一般具备如下特性： （1）能在宿主细胞中进行独立和稳定的自我复制，尽管有外源基因的插入，这种稳定的复制状态和遗传特性不会改变； （2）易于从宿主细胞中分离、纯化； （3）具有较小的分子量和松弛型复制子； （4）在载体DNA分子复制的非必须区内，存在有适当的限制性内切酶位点，最好是单一酶切位点，可供插入外源DNA分子，但不影响载体自身的复制； （5）具有能够观察的表型特征，如报告基因，这些表型特征可以作为筛选阳性重组DNA的标志。;报告基因：载体分子上的一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。最常用的报告基因为抗药性基因（抗氨苄、卡纳、四环等），发光基因越来越多的作为报告基因使用。; 克隆载体中都有一个松弛性复制子，能带动外源基因在宿主细胞内复制扩增。 表达载体是适合在宿主细胞中表达外源基因的载体，它必须具有强启动子和终止子，能够高效转录来自外源基因的mRNA。 用于cDNA克隆的载体通常为质粒载体和噬菌体载体。