酶组织化学总论---PPT.pptVIP

* Enzyme histochemistry 一. 概述 酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质 高效性 103-106倍 专一性 低反应条件 易变性失活 降低生化反应的反应活化能 酶活性的检测方法 广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术，都可用来测定酶活性 容量法（量气法） 比色法与分光光度法 荧光法与同位素法 离子选择电极法，旋光法 分子生物学，免疫化学法等 酶的组织化学 利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法 酶组织化学发展历史 1868年 Klebs 组化 1939年 Takamatsu、Gomori 碱性磷酸酶 1940-1960年 电镜酶组织化学 1955年 Scheldon 酸性磷酸酶 免疫酶组织化学 1970年 Sternberger 酶标抗体法 目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种 二. 酶组织化学反应的基本知识 酶的特性 酶的定位 酶组织化学的基本原理 （一）酶的特性 水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂 有机溶剂不同程度降低酶的活性 易受温度影响，对热耐受性弱 对干燥耐受性强 （二）酶的定位 酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位 5‘-核苷酸酶——浆膜 ATPase——肌球蛋白 细胞膜 线粒体 (三）酶组化的基本条件 同时保存结构和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位 保证反应产物的特异性 *影响酶活性的因素： 温度 PH值 抑制剂 激活剂 （四）原理及一般原则 1. 基本原理 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物） 然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物 该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在 第一反应：酶促反应 底物 初级反应产物（PRP） 第二反应：捕捉反应 PRP + 捕捉剂 终反应产物（FRP） 酶 * PRP弥散： 1. 底物在酶催化下水解的速度 2. PRP在缓冲液中的弥散系数 3. PRP与辅助物反应的速度 应选择合适的底物和辅助物, 减少弥散 捕捉剂的浓度 （1mg/ml） 2. 一般原则 对组织处理, 制片过程不能影响酶的活性及分布 所选底物和辅助物必须迅速, 同步穿透入组织和细胞中 所选底物最好只能被一种酶催化分解 所选辅助物不影响细胞内酶的活性, 不影响其他反应试剂的穿透性 PRP必须迅速与辅助物反应, FRP为水不溶性的有色稳定产物 所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合 (五) 酶组织化学的主要步骤 1. 酶的固定 （fixation） 2. 酶的特异性反应 （specific reaction） 3. 在最适条件下, 酶反应产物的沉着（precipitation） 4. 使沉着物具有可见性 （visualization） 组织/细胞 制作切片 酶反应（孵育） 显色 封片 镜检 （六）各步骤注意问题 检测方法的选择 酶的保存与固定 一般新鲜组织快速冷冻, 冰冻切片 -70℃长期保存 固定剂 1-4%多聚甲醛, 福尔马林, 戊二醛 固定时间 固定方法: 浸泡固定 灌流固定 固定温度: 0—4℃ （六）各步骤注意问题 3. 切片制作: 切片厚度40um 4. 缓冲液选择 缓冲液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反应孵育液 选择缓冲液应注意 A.不能减弱目标酶的活性 B.不能含有与捕捉机制相同的物质 C. 注意漂洗用缓冲液的渗透压 D. 漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同 （六）各步骤注意问题 5. 孵育反应 A. 孵育液配置 B. 孵育的温度和时间: 37℃ 15-30min C. 切片孵育法 -切片孵育 -漂浮孵育 （六）各步骤注意问题 6. 酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂 采用无底物的孵育液 过固定或加热 用针对目标酶的激活剂 改变孵育液底物 选择最适PH 酶细胞内的定位差异 （六）各步骤注意问题 7.