实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量测定.doc

实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 标准依据：GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 一、实验目的： 学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法。 二、实验原理： 试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。 三、实验试剂与仪器： （一）试剂g 无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5, 最后用水稀释到1L。 20%盐酸羟胺溶液。 1.0 mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL 。 50 mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。 二甘醇。 酸性氧化铝：80-120目。 二氧化铅。 硅藻土545：色谱层析级。 标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。 标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1μg/mL的标准溶液。-18℃避光保存。 混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。-18℃避光保存。 （二）仪器和设备 1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。 2、匀浆机。 3、离心机：4 000 r/min。 4、固相萃取装置。 5、25% PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm(4mm i.d)，两端附2(m过滤板，抽真空下，填装含有25% PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将PbO2氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。 6、酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5 mL乙腈活化。 四、实验步骤: （一）样品制备 提取 称取5.00 g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10 000 r/min的速度均质30 s，加入10 mL乙腈剧烈震摇30 s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30 s。 3 000 r/min离心10 min。把上清液转移至装有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL离心管中。然后在50 mL离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。 净化 在离心管中加入15 mL 二氯甲烷,振荡10 s， 3 000 r/min离心10 min， 将二氯甲烷层转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100 mL梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1 mL，用2.5 mL乙腈溶解残渣。 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5 mL, 把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5 mL乙腈溶解，过0.45μm 滤膜，滤液供液相色谱测定。 （二）色谱分析 1、液相色谱条件 a) 色谱柱： C18柱，250 mm (4.6mm（i.d.）， 粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25% PbO2氧化柱; b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7),梯度洗脱参数见表1； 流速：1.0 mL/min； 柱温：室温； 检测波长：618 nm(孔雀石绿); 588 nm(结晶紫)； 进样量：50 μL。 流动相梯度表 时间（min） 乙腈, % 乙酸铵缓冲溶液, % 0 60 40 4 80 20 15 80 20 15.1 95 5 17 95 5 17.1 60 40 20 60 40 液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2。 空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 五、计算结果与讨论： 结果计算和