系列3各种宿主细胞DNA残余检测技术的优劣.PDFVIP

生物制品宿主细胞残留DNA 检测进展 3. DNA 系列 各种宿主细胞 残余检测技术的优劣 2015年版的美国药典将新增章节对残余DNA 检测进行规范化，那究竟和 现有方法有什么不同？为什么最后只确定了一种方法？我们来看看现行美国药 典对于残余 DNA 检测的总体要求[General Chapter 〈1130 〉 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES-APPROACHES FOR DETECTING TRACE NUCLEICACIDS(RESIDUALDNATESTING)]。因为残留DNA 涉及到潜在来 源 （传染性病毒DNA）、管理规程等关键问题，药品监管部门建议必须建立产 品的DNA 残留检测方法。不论是否成品的常规检测包含DNA 残留含量检测， 还是工艺开发中已经证实了DNA 清除率，残留DNA 技术指标和定量分析监测 规程都必须确立。分析方法包括杂交法、基于DNA 结合蛋白的免疫色谱法 （阀 值法）、定量PCR （Q-PCR）或其他DNA 扩增方法。理想的定量检测方法的灵 敏度应该能够检测到约10pg/剂量的残留DNA。杂交法、阀值法和定量PCR 方 法因为灵敏度可以达到检测要求，所以属于经典方法。下面我们引用美国药典 （USP）1130的内容分别介绍一下这三种方法。 杂交法 （Hybridization-based）：在这种方法中，根据宿主DNA 序列设计 DNA 探针用于测定产品中配对DNA 的数量。双链DNA 被变性成单链后固定在 尼龙膜或硝化纤维膜上，DNA 探针被放射或荧光随机掺入标记以后，与膜上固 定的样品宿主DNA 杂交结合，并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点。对于荧 光标记的探针，斑点的光密度结果可以在仪器中定量分析。斑点光密度对应结合 在目标DNA 上的探针数，进而推测出残留DNA 的数量。通过目测方法可以半 定量地检测样品中残留DNA，仪器读片可以对应斑点光密度绘制标准曲线，对 应检测结果更加准确。 DNA 结合蛋白免疫阈值法 （DNA-BINDINGPROTEIN-BASED）：这种方 法使用DNA 结合蛋白和DNA 抗体，分四步检测。第一步，通过加热把DNA 变 性成单链DNA，变性后DNA 与偶联了亲和素的DNA 结合蛋白以及偶联了尿素 酶的DNA 单克隆抗体混合反应，液相中的单链DNA、DNA 结合蛋白、DNA 抗 体共同形成序列非特异的复合物。第二步，样品混合液通过生物素标记的膜，亲 和素-生物素结合把DNA 复合物固定在膜上，洗去非特异吸附。第三步，膜放入 - 1 - 生物制品宿主细胞残留DNA 检测进展 检测仪器中与尿素溶液反应，反应产物氨改变溶液pH 值并被仪器记录变化。这 种pH 值的变化直接与样品中的DNA 数目相关。第四步，仪器软件自动分析原 始数据确定样品中残留DNA 数量。 定量PCR 法 （QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR 方法以其快速、高 通量的特点已经被应用于生物制药的一些领域 （拷贝数检测与病毒检测）。这项 技术能够确定各种样品中目标DNA 序列的准确数量。DNA 探针的设计非常关 键，这种DNA 探针包含一端染料分子和另一端淬灭分子。当特殊设计的DNA 引物引导DNA 聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA 聚合酶切 断结合在目标DNA 上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。 经过数十个循环的DNA 扩增，荧光信号与起始DNA 模板成对应关系，对应标 准曲线可以准确计算出样品中残留DNA 的数量。 美国药典附录进一步对三种方法进行了应用评价。杂交法可以序列特异性 32 地检测目标DNA，但 P 标记的探针因为存在半衰期短、放射等问题，实际应 用并不广泛。荧光标记的探针如果采用仪器读取信号，杂交法理论上可以达到定 量检测要求的灵敏度，但是检测时间需要48 小时。阈值法因为是采用DNA 抗 体的非特异序列免疫检测技术，不能特异性识别宿主残留DNA 序列，且容易受 到环境和操作人员的DNA 污