6 基因操作及克隆载体 kaigyPPT.ppt

3. Analysis of a clone by restriction mapping G4 Ligation, transformation and analysis of recombinants 附实验二、感受态细胞的制备和外源DNA的转化 一、实验目的 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；掌握将外源DNA（如连接产物或重组质粒等）导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。 二、材料与试剂 大肠杆菌DH5?、p2300质粒、LB培养基、卡那霉素储存液等 三、实验方法 1.大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法） 1）将大肠杆菌DH5?接种于3 ml LB液体培养基，37℃振荡（220rpm左右）过夜（12h左右）培养（至对数生长期）； 2）将2 ml 过夜培养的菌液移入100ml LB培养基（一般为1：50的比例）中，37℃振荡培养至OD600nm为0.5-0.6；放于冰上30min。 3）取1ml菌液于1.5ml无菌eppendorf管中，4℃，4000rpm离心10min，去上清后，沉淀用1ml预冷的0.1M CaCl2（抽滤灭菌）悬浮，用枪头轻轻吹打混匀，于冰上放置30min； 4）4℃，4000rpm离心10min ，去上清， 沉淀再加200?l 的0.1M CaCl2重悬，冰上放置2-7h后，用于转化；或每管加20-30%的灭菌甘油，混匀，－70℃保存。 注意：新制成的感受态细胞在0℃放置12-24h这段时期内的转化效率较高 2.转化大肠杆菌感受态细胞 1）取上述方法制备的感受态细胞，或从－70℃冰箱中取出一管感受态细胞，融化； 2）按每200 ?l 菌液加100ng 已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将5-10μl DNA加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种； 注意：同时做两个对照组即受体菌对照组和质粒DNA对照组（检测感受态细胞的质量和有无污染情况） 3）42℃水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min； 注意：在水浴中切勿乱晃动 4）上述各管中分别加入800 ?l 37℃预热的LB液体培养基至总体积为1ml，混匀后37℃ 180 rpm培养1-2h左右至菌复苏（并使转化体产生抗性）； 5）4000 rpm离心10min，去800 ?l 上清液，将剩余的200 ?l 菌液混匀； 4）用烧烤过的涂布棒将100?l的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB固体培养基(含有IPTG和X-gal)，涂匀，晾于超净台上1h左右至菌液完全被培养基吸收。 注意：涂平板时，一定要等烧烤过的玻棒冷却后再涂布，否则会烫死细菌；另外，以上步骤应无菌操作，防止污染。 7）37℃倒置培养12-14h。从平板上用无菌牙签挑取抗性菌落（即白斑）进行鉴定。 Section H 克隆载体 Cloning Vectors 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 载体的功能 1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 能够独立于宿主细胞基因组之外进行自我复制与分离 autonomously replicating DNA independent of host’s genome. 容易从宿主细胞中分离纯化Easily to be isolated from the host cell 大部分是环形的 Most are circular, some are linear 含有至少一个选择标记 （即某个基因能赋予宿主对某种毒素的抗性，或使宿主细胞能在特定生长条件下生存 ，从而能使含有该基因的载体的宿主可从那些不含该载体的细胞中被筛选出来）Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not. 含有一个多克隆位点 Contains a multiple cloning site (MCS) 载体具备的特性 General features of a Vector 载体类型 vectors type 克隆载体 Cloning vectors: to clone a gene in a vector 表达载体 Expression vectors: allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated mainly at DNA level 整合载体 Integration vectors: allowing the e