7第七章目的基因在宿主中的表达PPT.ppt

2.4 常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要是中国仓鼠卵巢细胞CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS） 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 3.高等哺乳动物的载体系统 人腺病毒DNA 猴多瘤病毒DNA（SV40） 人乳多瘤病毒DNA（BKV） 人牛痘病毒DNA 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 3.1 人腺病毒DNA （1）腺病毒的生物学特性 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。 目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （2）腺病毒的基因组 腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%。 组成：（1）反向重复序列（ITR）；（2）E1-E4基因：早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子；（3）L1-L5基因：编码病毒包装蛋白的晚期基因；（4）IVa2、VA基因：为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。 E3区缺失：只影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段，使得载体的装载量提高到4 kb以上。 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （3）腺病毒DNA载体的特点 基因重排低：外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期 安全性能好：不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤 宿主范围广：对受体细胞是否处于分裂期要求不严格 使用效果好：外源基因在载体上容易高效表达 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 3.2 猴多瘤病毒DNA（SV40） （1）SV40的生物学特性 SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA。 SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。 SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （2）SV40的基因组DNA t / T基因：编码病毒的小抗原和大抗原，与病毒的致癌作用密切相关。 高效表达外源蛋白：SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白。 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （3）SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的 外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。 pV2-GPT：是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔β-珠蛋白。 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （4）利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （5）SV40 DNA载体的特点 基因表达好：外源基因能高效表达 基因重排高：病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象 宿主范围窄：只能转染猴细胞 装载量较小 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 3.3 人乳多瘤病毒DNA（BKV） （1）人乳多瘤病毒的生物学特性 人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝。 2011-10-22 * 目的基因在宿主中的表达 （2）人乳多瘤病毒表达载体的构建 删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体:不能整合，也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。 安装细胞色素P450 dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其启动外源基因的表达。 SV40来源的启动子控制Neor标记基因，以G418筛选重组子。 以此载体在人细