Tan第二章基因工程的工具酶PPT课件.ppt

欢迎同学们听课！ H.O.Smith and D.Nathans(1973)年提议的命名系统 粘末端(cohesive end)：DNA分子末端的单链片段能与其他DNA单链片段互补配对形成双链者，这两个DNA分子末端单链片段即为粘末端 识别序列核苷酸为奇数，切割总是产生黏性末端 影响限制性核酸内切酶活性的因素：a. DNA的纯度，b.DNA的甲基化程度，c.反应温度，d. DNA的分子结构，e.核酸内切限制酶的缓冲液 DNA上识别序列的侧面序列：PCR引物设计时，所加酶切位点的末端要加几个保护碱基；有例外：Sal I and Spe I等识别序列两侧不加保护碱基，同样可以被识别和切割。 DNA浓度常为50ul内含1ug DNA 实际的实验中所用的植物等DNA分子比?DNA分子要大，且复杂的多，所以实际使用的酶量往往大于理论估算值。 常用酶量：酶和底物比例为2~10u/ugDNA 有些需加BSA。对于那些在不同的反应缓冲液中有较高活性的内切酶，较利于进行双酶切。 商品限制性内切酶保存在50％甘油中 2.1.9 酶切注意事项 选择正确的酶 DNA的纯度和浓度 反应体系甘油的量5%（酶保存在50％甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反应总体积的1/10）。 酶保存在－200C；使用时在冰浴上操作。 反应体系各成分都加完后，再加酶。 每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。 酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。 防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。 2.2 甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。 （一）大肠杆菌中的甲基化酶 　　dam甲基化酶: 可在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I（TGATCA），但BamH I（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 　　dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。 （二） 甲基化酶在基因工程中用途　　许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoR I识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoR I的切割。 2.3 DNA连接酶 (DNA ligase) 2.3.1 E. coli 和T4 DNA连接酶 2.3.2 DNA片段之间的连接 2.3.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接 2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接 2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接 2.3.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接 2.3.1 DNA连接酶（DNA ligase） 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端和5 ’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。 用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。 提取：许多原核和真核生物及病毒中。 E. coli DNA ligase和T4 DNA连接酶 E.coli DNA ligase: Mr=74000, 作用于5端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。 T4 DNA ligase: 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。日常用的最多。 T4 RNA ligase: 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途是对RNA进行3＇末端标记 2.3.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接 一般较好连接，直接加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。 2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接 连接效率较粘性末端低，尽量避免采用。加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。 affecting factors T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5℃（4-15℃）。 DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 time：O/N better 2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接 DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端分别加上AAA，另一端加上T