DNA的生物合成-gaojuanPPT.pptVIP

基因克隆中的工具酶： 限制性内切酶：能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶 分布：主要在微生物中。 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有400～500多种。 基因克隆中的载体： 载体种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 质粒的特点: 细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子； 质粒是基因工程中最常用的运载体； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； 存在于许多细菌及酵母菌等生物中； 质粒的存在对宿主细胞无影响； 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。 第13章 DNA的生物合成 DNA复制的基本原则 原核生物DNA的复制 真核生物DNA的复制 逆转录作用 DNA的损伤与修复 DNA重组和克隆 中心法则 DNA复制：亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模板，合成子代DNA分子的过程。 模板 引物 dNTP DNA聚合酶 Mg2＋ 在5’-3’方向延伸 扩展的中心法则 半保留复制：DNA的两条链彼此分开各自作为模板，按碱基配对规则合成互补链。由此产生的子代DNA的一条链来自亲代，另一条链则是以这条亲代链为模板合成的新链。这种复制方式叫作半保留复制。 半保留复制的意义： 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 半保留复制 半保留复制 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。 复制子是独立完成复制的功能单位。 真核DNA复制中的多复制子结构 半保留复制-双向复制 DNA聚合酶Ⅰ 5’－3’聚合酶及外切酶作用 3’－5’外切酶酶作用 可校正/修复DNA链 可切除引物 DNA聚合酶Ⅱ 5’－3’聚合酶 3’－5’外切酶酶作用 可校正/修复DNA链 DNA聚合酶Ⅲ 与酶Ⅰ作用类似，酶活高， 是主要的DNA链延伸酶 原核生物DNA的复制-DNA聚合酶 引物酶： 合成RNA引物； DNA连接酶： 催化1个DNA片段的3’-OH与另一个DNA 片段的5’-磷酸基之间最后一个键的形成； DNA解旋酶： DNA双螺旋的解开； 拓扑异构酶：环状DNA复制时调整超螺旋的圈数 其它蛋白： 单链结合蛋白（SSB）等 原核生物DNA的复制-其他酶和蛋白质 DNA复制的起始 DNA链的延伸 复制的终止 复制原点：oriC 起始复合物 引发体 冈崎片段 半不连续复制 终止子 大肠杆菌DNA的复制过程 DNA解开成单链，提供模板。 合成RNA引物，提供3?-OH末端。 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 需要解决的问题： 大肠杆菌DNA的复制过程-起始 大肠杆菌DNA复制-DNA链的延伸 随着复制叉的推进，两条新链的合成方向不同： 一条链延伸的方向与复制叉前进的方向一致，它的合成能连续进行，称为前导链； 另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向相反，它不能被连续合成，需要复制叉推进了一定的长度，有了一段DNA单链后，才能以此为模板合成一个片段。 因此这条新链的合成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为随后链。 这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为半不连续复制。随后链中合成的多个DNA片段，称为冈崎片段。 大肠杆菌DNA的复制——终止 其环状的DNA从单点开始双向复制，当两个复制叉在复制原点的对面处相遇并合并时，结束复制，形成两个环状DNA分子。 复制的终止没有特殊的信号。 真核生物DNA的复制 真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处： 多复制起点 至少有五种聚合酶αβγδε 端粒的复制依赖于端粒酶 真核生物的DNA聚合酶 真核生物DNA的复制 ? 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 ? 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 ?增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。 （一）复制的起始 （二）复制的延长 （三）复制的终止 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。 端粒及端粒酶 端粒(telomere) 指真核生物