代谢工程1PPT.pptVIP

PCR 原理 什么是PCR？ PCR (polymerase chain reaction，聚合酶链反应) 利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的DNA复制过程，在附加的一对引物之间引发聚合酶反应，是体外DNA扩增技术。 Outline PCR的发明 PCR的应用 PCR原理 PCR条件优化 PCR污染 PCR产物分析 一、PCR的发明 1983 年由Kary Mullis 发明 1993 年获得Nobel 化学奖 /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis,KB (1990)The unusual origins of the polymerase chain reaction Sci.Am.262,56-65 “Sometimes a good idea comes to you when you are not looking for it ” Scientist and surfer from Newport Beach, California “Kary Mullis: perhaps the weirdest human ever to win the Nobel Prize in Chemistry…”— The Washington Post / 三、PCR原理 模拟体内DNA复制 体内DNA复制和PCR的比较 体内DNA复制 PCR 模板 DNA模板(基因组DNA) DNA模板(抽提的细胞总DNA、逆转录生成的cDNA、质粒DNA等) 核苷酸 dNTP 引物 RNA 引物 一对引物(ssDNA) 聚合酶 Klenow DNA 聚合酶(3’-5’核酸外切酶) 耐热的DNA 聚合酶(Taq) 辅助因子 Mg 2+ 其他反应成分 拓扑异构酶,连接酶, 引物酶, 解链酶,解旋酶 缓冲液(Tris-HCl, KCl,明胶) 石蜡油 PCR扩增片段的两个末端由一对引物的5’端限定 Taq polymerase 1976 年在水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中发现 依赖DNA的DNA聚合酶 A Chien, D B Edgar, and J M Trela in Journal of Bacteriology 127 (3): 1550–1557. 需要Mg 2+ 最适反应温度为72℃ 耐高温 没有3’→5’外切酶活性，错配发生率较高（0.25%） PCR反应体系 Reagents: DNA 模板: ? 1 μg dNTP(A,T,G,C) :20-200μM Primers:一对，0.1-0.5μM Taq 酶: 1-2.5 units MgCl2: 0.5-2.5mM Buffer: pH 8.3-8.8 PCR仪（Thermocycler） COMPONENT VOLUME Final Concentration 10 X PCR Buffer 5?l 1X 10 X dNTPs (2mM) 5?l 200?M Forward primer (10pmols/?l) 1?l 1?M (50pmols/50?l) Reverse primer (10pmols/?l) 1?l 1?M (50pmols/50?l) Genomic DNA template 2?l 1?g genomic DNA or 0.1pmol plasmid Thermostable polymerase (2U/?l) 0.5?l 1 unit H2O (to 50?l Final volume) to 50?l Final volume ? 50?l 反应体系 ANNEALING 37°C - 65°C EXTENSION 72°C 25-35 CYCLES DENATURATION 93°C - 95°C DENATURATION 93°C - 95°C 指数级扩增 Number of cycles Amount of DNA 2N N=# of cycles 2: # of starting strands 模板DNA 耐热DNA聚合酶 引物 至关重要！ 循环参数 四、PCR条件优化 核酸标本来源广泛：组织、细胞、血液、头发、唾液、精液 可以为DNA或RNA为模板 对纯度要求并不十分严格。 不含DNA聚合酶抑制剂，如多糖。 用量一般为1ug-2ug。 1. DNA 模板 产物大小 产物的产量 产物的保真度要求 模板的GC含量 产物的3’末端（TA cloning) 2. 耐热DNA聚合酶： 根据