凝集反应、沉淀反应PPT.pptVIP

2、抗体的质量 特异性高，无交叉反应； 效价高，避免低效价抗体引起的非特异性浊度； 亲和力高，免疫复合物形成快，结合牢固； R型抗体，等价带宽，亲和力强。 3、抗原抗体反应的溶液 最适pH6.5-8.5；在一定范围内，离子强 度大，IC形成快。 4、增浊剂 PEG，tween-20。消除抗原抗体周围的电子云和 水化层，促进加速IC的形成。 免疫比浊方法分类 透射比浊法 散射比浊法 免疫胶乳比浊法 第三节 凝胶内沉淀试验 可溶性抗原和抗体在凝胶中扩散，形成浓 度梯度，在二者比例适当的地方形成肉眼可 见的沉淀线或沉淀环。 一、单向扩散试验 (一)试管法 将混有抗体的琼脂糖溶液倒入试管，待其 凝固后在凝胶上面加入待检标本，如标本中 有相应抗原，会从上向下扩散，在浓度比例 合适的地方形成沉淀环。 (二)平板法 将混有抗体的琼脂糖溶液制成平板，在平 板上打孔，加入标本，如标本中有相应抗 原，会向四周扩散，在浓度比例合适的地方 形成沉淀环。沉淀环的直径或面积的大小与 抗原量有关，但不是直线相关，而是对数相 关，可通过相关公式计算。 示意图 （沉淀环直径)2 抗原浓度 1.抗体混于凝胶中 2.抗原加入孔内 3.抗原自由扩散 标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度 沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法 Mancini曲线： 大分子抗原 　时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线 Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 　常数K＝logC∕d 　半对数坐标纸曲线 C为抗原浓度， d为沉淀环直径 单向扩散试验 （平板法） 　　 T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线 　　 t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线 Mancini曲线 Fahey曲线 二、双向免疫扩散试验 (一)试管法 将混有抗体的琼脂糖溶液倒入试管，待其 凝固后在凝胶上面加入凝固后中间加一层普 通琼脂，凝固后将抗原加到上层待检标本， 抗原从上向下扩散，抗体从下向上扩散，在 浓度比例合适的地方形成沉淀环。 (二)平板法： 将抗原与其相应抗体放在凝胶（如琼脂）平板 的邻近孔内，使它们互相扩散，当扩散到两者浓度 比例合适的部位相遇时，即出现沉淀线。 原理示意图 Ab Ag 模拟图 染色标本图 1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧 结果分析： 抗原或抗体是否存在； 抗原或抗体的纯度；若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。 抗原或抗体相对浓度：抗原浓度越高，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越高，形成的沉淀线距抗体孔越远； 抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体在琼脂内的扩散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，局部浓度高，因此形成的沉淀圈弯向分子量大的一方，若二者分子量相等，则沉淀线呈直线； 抗原性质：观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分。同样的纯抗原a放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原a和b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分a和ab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。 滴定抗体效价：固定抗原浓度，稀释抗体，出现沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。 抗原、抗体相对分子量 Ag分子量大于Ab Ag分子量等于Ab Ab分子量大于Ag 三种双扩散 两Ag完全相同 两Ag完全不同 两Ag部分相同 第七章 免疫电泳技术 电泳分析与沉淀反应相结合的试验技术。 优点：1、加快沉淀反应的速度； 2、将某些蛋白组份利用其分子 量和/或电荷的不同将其分开、 集中后，再作更细微的分析。 一、对流免疫电泳 将双向免疫扩散与电泳两种方法的结合， 定向加速的双扩。 原理：在pH8.6的溶液中，大部分蛋白抗原带负电，在电场中向正极移动；IgG 分子量大，带的电荷少，在电场中虽也向正极移动，但速度缓慢。由于电渗引起负极移动的潮流速度超过了IgG向正极的移动，带动抗体移向负极，形成与抗原间的对流。二者相遇后，在最适比例处形成沉淀线。 阴阳极两侧打孔，阴极孔加入抗原，阳极孔加入抗体，通电后在两者间或抗体(抗原过剩)的另一侧形成沉淀线。 　　第五章