分子医学实用技术实验1-1PPT.ppt

琼脂糖凝胶电泳的用途与特点 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定 和纯化DNA片段的标准方法。 特点: 操作简便快速 可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 原理 琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 电泳指示剂： 常用指示剂 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色 二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 胶浓（%） 溴酚蓝 二甲苯青 0.6 1kb 1 0.6kb 2kb 1.4 0.2kb 1.6kb 2 0.15kb 影响凝胶电泳的因素 在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: DNA分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。 影响凝胶电泳的因素 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 影响凝胶电泳的因素 嵌入染料的存在 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 离子强度影响 缓冲液的组成及离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 　　 实验材料 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头， 　　微波炉，紫外透射检测仪等。 材料： 重组pUC119质粒DNA溶液,重组pUC119质粒的双酶切产物 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB）， 10X加样缓冲液 ：Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液 实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。也可电泳完毕后将胶浸于EB溶液中10分钟，尔后清水浸泡10分钟后紫外等下观察） ⑵ 插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入胶模，室温冷却凝固 ⑶小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 (4) 将4μl 的6X载样缓冲液加入酶切反应管中，混匀后，小心加入点样孔（1）。5ul质粒加1ul 6X载样缓冲液点样（2） ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 结果与分析 图1 基因组DNA1%琼脂凝胶电泳图 1 2 3 M 1 2