基因工程—获取目的基因PPT.pptVIP

基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 (一)、目的基因主要是______________________ 编码蛋白质的结构基因 （二）、获取目的基因的常用方法有哪些? 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成 限制酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 1)基因组文库(Genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 cDNA(互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库 2)cDNA文库 (cDNA library) 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA ---基因组DNA文库（总） mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分） ②基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 ①基因文库的分类 2、利用PCR技术扩增目的基因 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 生物体内DNA分子复制的条件 DNA聚合酶的特性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 小资料：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 ① ② ③ ④ ⑤ A T G C A T G C 5，端含磷酸基团 3，端含羟基 3，端 5，端 3’ 5’ 5’ DNA的复制方向 DNA 分子的热变性原理 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物与两条单链结合 在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 PCR原理 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 PCR 反应的条件 ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶； ⑤控制温度，但不需解旋酶； ⑥需要在一定的缓冲液中进行。