基因工程-第四章-目的基因的分离和合成PPT.ppt

苏州科技学院生物系 叶亚新 染色体巡查示意图 5. 蛋白质-DNA杂交法 ?? 1) 原理 ?????利用某些基因产物可与DNA分子上特异序列结合的特点分离那些参与基因表达调控的基因 DNA探针可以是调控蛋白结合的序列，其长度尽可能短且能获得杂交斑点。小于150bp的DNA探针可大大降低非特异性结合。DNA探针必须是双链，否则会导致大量的非特异性结合。 必要条件：目的基因或cDNA必须在宿主细胞中表达 ?? 2) 操作步骤 基因文库 → 制备蛋白质样品膜 → 与标记DNA探针 → 阳性克隆 →序列测定 → 基因表达 → 蛋白质-DNA结合实验 → 特异性DNA序列分析和进一步确证实验（足迹分析技术等） 6. 蛋白质-蛋白质结合法酵母双杂交法 1)?原理 利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因表达筛选目的基因的方法。 i.?? GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列； ii.??GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。这两个结构域可以单独起作用。 酵母的双杂交系统示意图 iii.?如果AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互发生结合，就可导致GAL1-LacZ基因的表达。其中与BD融合的基因称之为钓饵基因，与AD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文库)。 为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以与HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表达量足够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。 2)??操作步骤 构建钓饵融合基因（BD） 转化相应的酵母菌株 在检测平板上筛选 构建文库（AD） 阳性菌落 提取质粒DNA，转化大肠杆菌 阳性克隆的进一步鉴定 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑下列问题： 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列 TGT ATGGAC GAAATG AAAAGA AACATA C T GA TG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me