基因的克隆与表达-2005PPT.ppt

lacZ基因编码?-半乳糖苷酶 lacI基因编码阻遏蛋白,使lacZ不能表达 诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达 乳糖操纵子 乳糖操纵子的表达调控 pUC载体(含lacZ’、lacI基因） 诱导物(IPTG) lacZ’表达 ?-半乳糖苷酶N端片段（?-肽） 宿主细胞lacZ?M15 缺陷型?-半乳糖苷酶 ?-半乳糖苷酶 X-gal变兰色 pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活1 pUC载体(含lacZ’、lacI基因） 外源基因插入 lacZ’失活 不产生?-半乳糖苷酶N端片段（?-肽） X-gal不变色，呈白色 pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活2 3、 pGEM系列 pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子 pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子 1、可进行体外转录 转录具有特异性 可分别转录插入片段的两条链 转录产物可制备体外翻译的模板、探针及反义RNA 2、为插入片段的测序提供特异引物位点 pGEM-3/4Z----MCS位于lacZ’基因内部 插入失活—蓝白斑筛选 具有SP6、T7启动子 pGEM-3Zf(+)/(-)----引入丝状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点 可以产生单链DNA，并分泌至上清中，便于对插入片段进行测序 F1的方向(+/-)决定复制哪一条链 4、 T-vector—用于PCR产物的直接克隆