临床PCR检验标本的采、处理、保存及核酸提取方法(PPT-64).ppt

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法 江西省肿瘤医院 陈文学 检验误差的发生率 1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9% 正确采集、运送、保存临床标本的重要性 质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一 核酸提取的重要性 核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分 核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否 临床PCR检验操作中最易出问题的环节 标本采集 标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或过晚都可能会出现假阴性结果） 标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化学分析） 采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌） 标本运送 样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。 临床标本的处理和保存 血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织 血清（浆） DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下。 全血 以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA 。 外周血单个核细胞 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下. 痰 痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下。 痰标本处理的基本模式 通用模式 简单模式 痰标本处理通用模式 （1）通用标本处理（Universal sample processing, USP）溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20) 痰标本处理简单模式 试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白酶K和0.05% Triton X-100 痰标本处理中要注意的问题 痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。 棉拭子 在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。 如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下. 脓液 脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再