MET基因复制数量的增加赋予单克隆抵抗体抗MET的能力且建立药物依赖性.docVIP

MET基因复制数量的增加赋予单克隆抵抗体抗MET的能力并且建立药物依赖性 关键词：MET ，MV-NV30单克隆抗体，酪氨酸激酶抑制剂，抗性，药物依赖性 【摘要】：被MEI原癌基因编码的酪氨酸激酶受体领导了具体抑制剂的发展并在癌症中起很重要的作用，其中现在一些正处于前进的临床试验阶段就以前的经验表明对大多数靶向治疗最主要的限制是抗性的出现。在对MET单克隆抗体抗性和抗体对化学抑制剂旁路抗性（反之亦然）一无所知时，酪氨酸激酶抑制剂对MET的抗性机制就已经被提出。EBC1型肺癌细胞是MET基因扩增的结果，并且这种细胞对MET抑制剂非常敏感，包括MET单克隆抗体的单机形式在内。我们培养生成抵抗抗体的细胞发现这种抗性是由于MET基因大量复制扩增和它的受体显著表达而来。这种过度表达可以使单克隆抗体的“脱落”活动达到饱和，并且能够防止表面的MET受体的有效的下调和抑制剂的活化作用。值得注意的是MV-DN30抗体的抗性细胞是MET耐受细胞对MET酪氨酸激酶抑制剂也很敏感。除此之外，抗体抗性细胞还具有药物依赖性,MV-DN30的去处导致它们死亡是由于它们的过度信号表达。在实验中，对MET酪氨酸激酶抑制剂存在抗性的细胞仍然对MV-DN30抗体的作用敏感。结果表明一种不连续的通过抗体和化学激酶抑制剂联合治疗可能会使靶向治疗的临床反应和对MET抗体治疗旁路的抗性增加。 缩略语：MV-DN30--单价DN30，TKEs—酪氨酸激酶抑制剂，HGF—肝细胞生长因子，MAPK—有丝分裂原活化蛋白激酶 1.简介 可以抑制一个特定的目标分子化合物的靶向治疗法开辟了治疗癌症的新道路。与主要杀死扩散细胞为主的传统化疗不同的是靶向药物对肿瘤细胞采取一种更具体的治疗方式。靶向治疗依赖于“癌基因沉瘾”的概念。这就意味着单个基因的抑制或死亡是由于它们的沉瘾，或者至少抑制它们的生长（温斯坦,2002Achille’s heel”的识别提供支持（温斯坦巴塞尔加，2006; Gschwind等人，2004 我们以前报道过主要针对细胞外的部分MET的抑制性单克隆抗体的研究进展。它的诱导、再结合、达到MET脱落阈值的能力使其有抑制活性，剩余的跨膜片段通过蛋白酶体降解途径处理掉。因此，DN-30结合到MET后的结果是使其变成可溶性的诱饵MET并且蛋白水解酶会讲解MET激酶。 这促进了MET介导的生物活性的抑制作用。设计了这样一个过程就是因为DN-30的结合使得MET激酶部分活化并且导致抗体介导的受体同源二聚体化和单价Fab片段失去竞争活性的一个过程。 在这个研究中我们表明了不断用MV-DN30来治疗沉瘾癌细胞会使其具有抗性的原因是MET基因的大量复制和MET的过度表达超过了MV-DN30对其有效下调并使其失去活性的的能力。值得注意的是，MV-DN30抗性细胞还会一直对MET TKIs产生耐受性和敏感性。有趣的是，它们获得了药物耐受性，当受到MV-DN30的驱除致死它们的是过多的信号表达。我们还表明对MET TKIs 有抗性的细胞也对MV-DN30敏感，所以，MV-DN30和MET TKIs 对肿瘤细胞的作用是相互促进的。 2.材料与方法 2.1.细胞和试剂 EBC1 细胞从一个患有转移皮肤肿瘤的病人取得，这个患者还患有肺鳞状细胞癌，病例是从日本癌症资料库购买得到。 GTL16 是一种实验室里的克隆胃癌细胞系。HEK-293T细胞系分离于人类胚胎时期的肾，A549细胞系来源于肺癌，都是从ATCC购买来培养的。对MV-DN30有抗性的EBC1细胞可以通过一个逐步的方法培养得到，由Sigma Tau RD 提供的通过暴露亲代细胞方法来增加抗MET单价单克隆抗体的浓度。亲代细胞用10 mg/ml 的MV-DN30治疗约一个月，直到生成的R10细胞开始产生抗性为止，R10抗性细胞又用逐步增加浓度的MV-DN30治疗。所有的抗体耐受细胞培养在存在MV-DN30并且可以使它们产生耐受性的条件下。大约两个月可以分离到R20抗体抗性细胞，四个月可以分离到R80抗体耐受细胞。EBC1 and GTL16 细胞对MET TKIs PHA-665752 (EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM) 都有耐受性，并且向描述的那样培养可以一直保持PHA-665752的存在。该细胞系的遗传身份通过一个短的串珠状重复序列（STR）识别，这段序列在2013年7月再次重复出现。We 我们利用下面的小分子：ATP竞争行MET TKIs PHA-665752 (Tocris Bioscience) and JNJ(John-son Johnson) 和p38MAP激酶抑制剂SB203580 (Merck). 2.2. mRNA和基因组DNA的分析 用Trizol