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凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * B DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带表明DNA与蛋白质结合 鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与特定DNA片段结合的蛋白质分子 研究发生此种结合之精确的DNA序列的特异性（加入超量的非标记竞争DNA） (a) (b) (c) 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 （a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。 * * * * * * * * * * 蛋白质与未标记的竞争DNA结合 凝胶电泳 放射自显影 蛋白质与标记的探针DNA结合 * * * * * * * * * * 可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。 1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子 2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变，可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。 凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。 DNaseⅠ足迹实验可以解决这个问题 DNase Ⅰ－DNase，牛胰脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解DNA磷酸二酯键的酶 优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链和单链DNA 产物是以5’-磷酸为末端的寡核苷酸和单核苷酸混合物 切割位点随机分布 DNaseⅠ足迹实验 DNaseⅠ足迹实验 DNaseⅠ footprinting assay 原理：DNA－蛋白复合物形成后，结合在DNA上的蛋白质将保护结合位点的碱基序列不受DNaseⅠ或某些化学试剂的作用而发生降解，在高分辨电泳胶上将观察到一段无顺序信号的中断区域，形成一个空白带，好像蛋白质在DNA上留下的足迹 一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。测定反式作用因子与DNA序列相互作用确切位点的方法。 优点：形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。 步骤，与DNA化学测序法有些相似 将待测的双链DNA片段中的一条单链进行末端标记， 加入适当浓度的DNase Ⅰ，使在DNA链上随机形成切口， 经变性成单链后进行电泳，以分子从大至小被分离，从而形成相差仅一个核苷酸DNA梯度条带， 对于与结合蛋白相结合的区段，DNase Ⅰ不能切割，留下一个空白带 32p 1 5 10 * 1 4 8 10 * 加入蛋白质X 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 1 5 10 A B 足迹 (a) (c) (b) DNase I 足迹实验 transcription factors that bind eukaryotic operators, enhancers, and silencers hormone-receptor complexes that bind to their hormone response elements the lac repressor that shuts down the?lac operon in E. coli 如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。 如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。 硫酸二甲酯（DMS）足迹实验 DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。 甲基化干扰实验methyltion interference assay 根据DMS使G残基甲基化，六氢吡啶特异切割甲基化的G残基，设计出了另一种研究DNA与蛋白质