端粒酶PPT.ppt

第九讲;美国3名科学家获2009年诺贝尔生理学或医学奖 ;(Elizabeth Blackburn) （美国加利福尼亚旧金山大学）;(Carol Greider) （摩约翰·霍普金斯医学院） ;(Jack Szostak) （美国哈佛医学院） ;DNA聚合酶在复制DNA的时候必须要有引物来起始，而且它的酶活性具有方向性，只能沿着DNA5’到3’的方向合成。 染色体复制之初可以由小RNA作为引物起始合成，之后细胞的修复机器启动，DNA聚合酶能够以反链DNA为模板，以之前合成的DNA为引物，合成新的DNA取代染色体中间的RNA引物。 但是线性染色体最末端的RNA引物因为没有另外的引物起始，没有办法被DNA取代 。所以线性染色体DNA每复制一轮，RNA引物降解后末端都将缩短一个RNA引物的长度，这个引物不长，但是细胞千千万万代地不断复制，如果不进行补偿，染色体不断缩短，最终就会消失。 ;James Watson指出了这个“末端隐缩问题”，并猜想染色体也许可以通过在复制前联体（染色体末端跟末端连起来）的方式来解决末端复制的问题 ;早在1939年，潜心玉米遗传性状研究的Barbara McClintock女士（玉米的转座子发现者）注意到，在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新融合起来形成“桥”。在紧接着的有丝分裂中，这种染色体“断裂－融合－桥－断裂”的循环不断继续。;既然染色体的断裂末端这么容易相互融合，那么染色体的自然末端，为什么不容易相互融合呢？合理的推测是，染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端，它应该有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合。遗传学家Muller和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，Muller将这一结构命名为端粒（telomere）。  ;端粒DNA序列的发现以及人工染色体的发明; (四膜虫有两个细胞核。小核很稳定，含5对染色体，用于生殖传代。而大核在接合细胞的发育过程中，染色体断裂成200-300个小染色体，rDNA从染色体上断裂后通过复制更是形成高达～10000个小染色体,四膜虫的小染色体众多，也就说端粒可能非常丰富。这就为端粒研究提供了得天独厚的材料);1980年，当Elizabeth Blackburn女士在会议上报告她的这一发???的时候，引起了Jack Szostak的极大兴趣。 他那时候试图在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中建构人工线性染色体，让它能够在细胞中像自然染色体一样复制。;但是当环状质粒线性化转入酵母细胞后,它很快地被降解掉。它的降解是不是因为它的末端没有端粒保护呢？ 端粒序列的发现让Jack Szostak有机会把线性质粒末端连接上四膜虫的端粒DNA，然后再导入酵母细胞。 奇迹发生了，线性质粒不再降解，它可以在细胞内复制，人工染色体的想法实现了 ! ;人工染色体的实现使DNA的大片段克隆成为可能，后来为人类基因组测序的工作立下了汗马功劳。这也是Jack Szostak共同获得诺贝尔奖的重要原因。 1984年， Elizabeth Blackburn实验室通过将酵母端粒克隆到线性人工染色体的方法，发现酵母的端粒序列是由不太规则的TG1-3/C1-3A重复序列组成的. ;端粒复制的两个假说以及端粒酶活性的发现;究竟是重组还是全新的酶？为了理清这两个假说，Elizabeth意识到最重要的是找到这个“酶”。 如前所述，在四膜虫接合细胞的大核发育过程中，大核产生了非常丰富的小染色体，每一个小染色体都被从头加上了端粒。可以推测，如果“酶”的假说成立，此时细胞内的“酶”活性应该是非常高的。;1984年，Carol女士作为博士生加盟了Liz实验室。 她们俩精心讨论设计实验，用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温育，试图在体外检测到这个“酶”活性，看到端粒的延伸。 经过不断优化条件，尤其是把底物换成体外合成的高浓度的端粒DNA后，同年的圣诞节，勤奋的Carol同学打开暗盒曝光x光片，终于清楚地看到了“酶“活性。 ;在测序胶的同位素曝光片上，端粒底物明显被从新加上了DNA碱基，而且每六个碱基形成一条很深的带，与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合。 这种酶活性不依赖于DNA模板，只对四膜虫和酵母的端粒DNA进行延伸，而对随机序列的DNA底物不延伸；并且该活性不依赖于DNA聚合酶。 由于同源重组对序列没有特异性的要求并且依赖于DNA聚合酶的活性，至此，她们澄清了这两种假说，证明了有一种“酶”来延伸端粒DNA。这种酶后来被命名为“端粒酶”（telomerase）。;端粒酶RNA亚基的发现;端粒酶会不会是另外一种特殊的RNA催化酶？ Tom Cech 开始被