第七章 植物原生质体培养及细胞融合2014PPT.ppt

内容 植物原生质体分离， 植物原生质体培养， 植物细胞融合。 要求 了解原生质分离、纯化、活力测定及其影响因素， 掌握植原生质体培养的方法、步骤和影响因素； 理解植物细胞融合的原理及方法。; ;原生质体培养意义;;材料预处理;2. 酶分离法;细胞壁的组成;酶的种类及特点;原生质体酶分离法;酶液的配制; 如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。 ①糖溶液系统 包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂； ②盐溶液系统 包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。 　　 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 提高原生质体的稳定性；使RNA酶不活化；并使离子稳定。 ;◆pH;分离叶肉原生质体的完整流程;（一）原生质体的纯化 1. 沉降法（过滤离心法）-应用最广 利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。 过滤酶处理混合液，30-40μm微孔滤膜， 低速离心，150g以下，3-5min，弃上清， 用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤， 重复2-3次， 1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。 优点：操作方便；损失少。 缺点：纯度不高;2. 漂浮法;3. 界面法;纯化后的叶肉原生质体;（二）原生质体活力的测定;一、供体植物的选择 供体组织的生理状态很重要。 一般情况下， 在可控光、温、湿的环境条件下能得到重复的结果， 即在无菌条件下生长的幼苗制备原生质体较好。;1. 基本培养基 MS和B5，或其衍生的培养基。 CaCl2促进细胞分裂。 钙可增强原生质体稳定性，提高分裂频率， 明显改变细胞质内外的离子交换。 NH4NO3降低细胞分裂频率。 2. 生长调节物质 生长素/细胞分裂素类。 针对不同的研究对象， 培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。 ;3. 渗压剂 在没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，原生质必须有培养基渗透压的保护。高渗溶液，培养时一般逐步过渡。 通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。 MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇 4. pH：5.6-6.0 培养基 用醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌。;新分离出来的原生质体 应在散射光或黑暗中培养。 培养温度一般在25-30℃下。; ; 原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,—暗培养—5-7天原生质体开始分裂。  优点原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系；可定位观察。缺点原生质体易受热伤害，易破碎；原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。 ;原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层；上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。  优点原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系；能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。缺点原生质体易受热伤害，易破碎。 ;;五、低密度培养;1. 培养基;2.培养方法;2种类型的活跃代谢和正在分裂的原生质体混合在液体培养基中一起培养。用于某些物种原生质体或杂种细胞的培养。条件2个物种原生质体间能发生有效的互馈；其产生的愈伤组织形态上能彼此区分。;3）Cuprak微滴法;六、细胞壁的形成;原生质体培养的程序;一、原生质体融合意义原生质体融合也称体细胞杂交，即，分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下互相融合成一体。 自然条件下，原生质体自然融合频率极低，必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。;;甘薯 原生质体融合植株;1. 化学法融合 1）无机盐诱导融合 1909年，Kuster证实， 低渗NaNO3处理 可诱导发生质壁分离表皮细胞2个原生质体融合。 缺点 异核体形成频率不高， 尤其是对于高度液泡化的叶肉原生质体。;Carlson等（1972） 获得第一个体细胞杂种;2）高pH-高钙离子诱导融合;高国楠等（1974）提出，现被广泛采用。滴150μl混合