第五章 分子生物学的研究方法-DNA序列分析PPT.ppt

基因工程 第二章 基因工程技术原理 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 ---生命科学院分子生物学 第五节 DNA核酸序列分析 返回目录 返回第二章 目的与要求 掌握DNA测序的一般原理和方法，通过学习，分析DNA策序与蛋白质策序的区别。 重点： Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法 难点：如何根据凝胶电泳直接读出DNA序列 学时：2学时 学习方法：课堂讲授与讨论相结合 2.3.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.3.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■ 2.3.3 序列分析自动化■ 2.3.4 杂交测序■ 2.3.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.3.6 思考问题■ 2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。 返回 DNA核酸序列分析历程 1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu） 独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列； 1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法； K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法； M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。 引物—延伸测序策略 反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及 四种dNTP（有一种带放射性标记）。 变性胶电泳分离反应混合物。 放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。 结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。 考考你：反应混合物中，标记什么最方便？ GTACGTTGACGCC ddATP ddTTP ddGTP ddCTP ddCTP ddATP ddGTP ddTTP AGTCAGGATCACC 考考你 酶、原料比例 在实际的DNA合成反应中，使用失去了5’ →3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。适当地调整ddNTP和dNTP的比例，便能够获得良好的电泳谱带模式。 dNTP／ddNTP=1：100时，谱带分离效果较佳，可读出多于 200个以上的核苷酸顺序。 降低ddNTP对dNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。 dNTP／ddNTP与良好的电泳谱带模式的关系如何？ 2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法 引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷 分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？ 为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。 实际上可行吗？ 高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。 这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。 克服缺点的一种途径—DNA分子克隆 将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。 引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。 M13载体克隆DNA片段 将DNA片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于 Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。重组体噬菌体，在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链