第五章 动物细胞制药PPT.ppt

生物技术制药;第 五 章动物细胞制药;第一节 概 述;第二节动物细胞的形态和生理特点;;⒉悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 ⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。;二、动物细胞的化学组成与代谢;;三、动物细胞的生理特点;G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时 G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为2~5h。 M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。;;;⒉ 细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。 ⒊ 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系 ⒋动物细胞对周围环境十分敏感。 对理化因素敏感，如： 渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。;⒌动物细胞对培养基要求高。 12种必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。 ⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体; 游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。;动物细胞生产药物 缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。;第三节 生产用动物细胞的要求和获得;二、生产用动物细胞的获得; ⒉ 二倍体细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。 生产药品：WI－38、MRC－5、2BS; ⒊转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。 转化过程可以是自发的、人工的或从肿瘤组织中建立 ;4.工程细胞系;???、常用生产用动物细胞的特性;MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。 有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。;Namalwa：从肯尼亚淋巴瘤病人（Homo sapiens，human)中分离获得的类淋巴母细胞，含有部分Epstein-Barr病毒基因，但不表达完整的EB病毒。 ;悬浮生长，非整体核型，2n=12～14，单X染色体，无Y染色体。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大规模生产干扰素，并批准上市。;2、哺乳动物细胞株系 CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。 核型： 2n=20～22。 贴壁型生长，也可悬浮 培养基：DEME培养基 0.1mmol/L次黄嘌呤，0.1mmol/L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。;BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏 中分离的。 成纤维样细胞,核型为2n=44; 培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。; Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 贴壁依赖的成纤维细胞， 核型2n=60； 培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。 ;SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分离获得。 能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml但在含HAT 选择培养基中不能存活。 通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛血清。 用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。;3、昆虫细胞株系 Sf-9: 1983年从亲代IPLB—SF21AE中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。