第六章 目的基因的分离2014PPT.ppt

由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆 常规PCR衍生的几种基因克隆技术 反向PCR 锚定PCR 逆转录PCR cDNA末端的快速扩增(RACE) (一)热不对称交错PCR(tail-PCR) 也是获得已知DNA序列侧翼未知序列的一种PCR方法 设计3个嵌套的特异性引物和一个短的随机简并引物,以DNA为模板,根据引物长度及特异性差异设计不对称的温度循环,通过分级反应扩增特异产物 一般分三轮反应: 第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物： ①由特异性引物和简并引物扩增出的产物；②由同一特异性引物扩增出的产物；③由同一简并引物扩增出的产物。 第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 四 化学合成法 化学合成目的基因的前提条件是基因编码的氨基酸序列或基因的DNA序列已知 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的 化学合成的单元操作 * 基因工程的基本步骤 目的基因的获取 基因载体的选择与构建 目的基因与载体的拼接 重组子导入受体分子 外源基因的表达和产物的分离 第六章 目的基因的分离 基因工程的上游工程是目的基因的制取和无性繁殖。 具体地说是从生物体的组织、 器官或细胞制取目的基因，或人工合成目的基因，使目的基因与载体连接，导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程称为基因克隆（gene cloning）。 克隆的概念: 个体水平上: 表示由具有相同基因型的同一物种的两个体或数个个体组成的群体,如双胞胎. 细胞水平上:由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体. 分子水平上:凡带有一段DNA插入序列的,独特的寄主/载体单元亦叫克隆.比如重组质粒载体 克隆基因的方法 PCR或人工合成法 从基因组文库或cDNA文库中分离基因 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法  基因文库：指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合 按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为：基因组 DNA 文库（genomic DNA library）和 cDNA 文库（complementary DNA library）。 从基因文库中克隆目的基因 cDNA文库特点 只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定的状态是由特定基因的表达所决定，因此各自的mRNA的种类不同，由此产生出独特的cDNA文库。任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。  cDNA文库的优越性 以mRNA为材料,特别适用于某些RNA病毒 筛选比较简单易行. 假阳性概率低 cDNA克隆可进行原核表达 构建cDNA文库应满足的条件 文库的代表性:文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性. N=Ln(1-P)/Ln(1-n/T) P:文库中筛选出某一确定克隆的置信度,一般情况下选择0.99. N:文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数; n:细胞中最低丰度的mRNA的拷贝数; T: 细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数 重组cDNA片段的序列完整性 (二)、构建cDNA文库的方法 （