第四章 克隆载体PPT.ppt

;基因工程的基本程序及研究策略 ;基因工程的目的;载体---基因工程中的重要工具;载体的两种扩增方式---自主复制型载体和附加载体;第一节 概述introduction;二、特点(vectors which are used in genetic engineering should:);按复制起点划分克隆载体 质粒复制型—复制起点来自质粒 ARS复制型—ARS（autonomus replicative sequence)，或称染色体复制型 病毒复制型—复制起点来自病毒 混合复制型 同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或病毒形式存在 不同生物复制起点混合—穿梭载体（shuttle vector）两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在;复制起点种类与拷贝数间的关系;;;三、 克隆载体必备条件;;;;（一） 一般特性(features);质粒的不相容性：是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 ;（二）分类(classification);?复制类型：;?构型：;（三）质粒的命名;（四）克隆质粒的改建(how can cloning vectors be made); 向天然质粒中引入选择标记, pSC101;4、发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 ;单标记、复制效率低（平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝）;? ? ;（五）常见人工构建质粒的分类:according to their functions,plasmids can be classified into:;;（六）常用质粒介绍detail introduction of several plasmids;质粒命名原则 4.36kb 双标记 分散的多个单一酶切位点 插入灭活 双抗菌素对照实验;插入失活、双抗菌素对照实验;pBR322衍生质粒;2、 pUC18/19—pBR322的重要衍生质粒;1983年构建：pBR322+M13 基本元件：ori Ampr MCS 辅助序列：lacZ’基因 lacI基因 ;lacZ基因编码?-半乳糖苷酶 lacI基因编码阻遏蛋白,使lacZ不能表达 诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达;;;pUC载体(含lacZ’、lacI基因） ;;pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子;pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子;pGEM-3/4Z----MCS位于lacZ’基因内部;pGEM-3Zf(+)/(-)----引入丝状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点;4、 T-vector—用于PCR产物的直接克隆;5、pCDNA3----穿梭载体;;小 结(conclusions);二、 ?噬菌体载体Bacteriolphage ?;（一）λ噬菌体的分子生物学biological features of bacterophage ?;噬菌体生物学性状介绍 3、基因组成： 48.5 kb in length；Linear or circular genome (cos ends) Cos位点（cohesive end)： λ DNA分子两端各有一个12碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称 cos位点 左臂（编码外壳蛋白）：头部基因（7个）、尾部基因（11个） 右臂（负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控)：裂解基因（2个） 中间段(控制基因组整合到寄主基因的基因)：DNA复制及溶菌生长非必需区（重组基因、正调控基因、负调控基因）、DNA合成基因;cos位点的作用 ;4、生活周期—温和性噬菌体;（二）λ－DNA载体的构建;;; Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends);自然选择法：利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细