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世和基因内部培训材料 —— NGS与其他检测序技术流程的对比2016年7月 Copyright © 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 临床常用诊断技术 2 Copyright © 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 肿瘤诊断方法 影像学诊断：超声，CT，MRI，PET，PET-CT 组织细胞形态学诊断： - HE染色 - 辨别肿瘤细胞及分型 免疫组化诊断： - 利用抗原抗体结合反应原理 - 针对蛋白类肿瘤标记物（癌胚抗原，糖类抗原， 甲胎蛋白等）的检测 - 鉴别组织来源 分子诊断： - 荧光原位杂交（FISH）、基因探针及标记、多聚酶链式反应（PCR）、 DNA序列分析（sanger测序、ARMS法、二代测序）等 - 针对肿瘤的癌基因/抑癌基因、生长因子及受体, 以及肿瘤相关的某些染色体 位点异常的检测 3 组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准” 4 FISH ARMS 肿瘤 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代 免疫组化 一代测序 数字PCR 二代测序 检测方法的介绍 免疫组化（IHC） 荧光原位杂交（FISH） 桑格测序（Sanger测序法） 扩增阻滞突变（ARMS）-PCR法 数字PCR（ddPCR） 二代测序 6 Copyright © 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 检测方法介绍 免疫组化染色 7 原理：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（DNA），一个是果（Protein），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来的。 0分 1分 2分 3分 荧光原位杂交（FISH） 定义：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 分析 9 Copyright © 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 荧光原位杂交(FISH)检测——以HER2为例 FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例 高倍扩增 无扩增 扩增 无扩增 DNA序列测定的意义 DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。 桑格测序原理 原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。 在测序引物引导下，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。  13 Copyright © 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. Sanger测序的流程 结果解读 扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引物的3’ 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物。